淫羊藿苷對成骨細胞中β—catenin、ALP和RUNX2表達的影響

周先進+張延芳

[摘要] 骨質疏松是由成骨細胞引導的骨形成小于破骨細胞引導的骨吸收導致的骨量丟失而引發的。按照中醫理論，中藥淫羊藿能夠治療骨質疏松，有研究表明其特征成分淫羊藿苷能促進骨形成，改善堿性磷酸酶（ALP）活性，調節β-連環蛋白、ALP和特異性轉錄因子2表達，但對成骨細胞的增殖與分化的影響并不一致。因此，淫羊藿苷應用于臨床治療骨質疏松有較好的前景，但其作用機制還需要進一步的研究。

[關鍵詞] 淫羊藿苷；β-連環蛋白；堿性磷酸酶；特異性轉錄因子2

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（c）-0057-04

[Abstract] Osteopenia is caused by the loss of bone mass when bone formation guided by osteoblasts is less than the bone absorption induced by osteoclasts. According to the traditional Chinese medicine， herba epimedii can treat osteoporosis. Besides， studies have shown that Icariin， the characteristic component of herba epimedii can promote bone formation， improve the alkaline phosphatase （ALP） activity， and also up-regulate the expression of key factor beta-catenin， ALP and runt-related transcription factor 2 of osteoblast. However， Icariin has different effects on the proliferation and differentiation of osteoblasts. Therefore， Icariin has an attractive prospect in clinical treatment of osteoporosis， but its mechanism needs further study.

[Key words] Icariin； β-catenin； Alkaline phosphatase； Runt-related transcription factor 2

骨質疏松（osteoporosis，OP）是一種以低骨量和骨組織微結構破壞為特征，導致骨質脆性增加和易于骨折的全身性骨代謝性疾病，好發于老人及絕經后婦女。世界衛生組織統計，全球患者可達到2億例，其發病率已經躍居世界各種常見病的第7位，嚴重威脅著人類的身心健康。OP的防治已經成為世界性課題。目前現有的治療OP藥物存在過敏、食管刺激和價格昂貴等缺陷[1]。而中藥在這些方面問題較少，具有價廉易得，副作用小特點。在傳統中醫理論中，OP屬于骨痹范疇。中藥淫羊藿，具有潛在的促進骨愈合的作用，可促進成骨細胞（osteoblasts，OB）活性，抑制破骨細胞（osteoclast，OC）分化，具有良好的骨誘導性；其發揮藥效的主要成分為黃酮苷類，淫羊藿苷（Icariin，ICA）是其中主要的黃酮苷[2]。β-連環蛋白（β-catenin）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）和OB的特異性轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）是OB增殖分化的重要指標，本文通過探討ICA對OB中β-catenin、ALP和RUNX2表達的影響，為中藥防治OP提供依據。

1 淫羊藿的衍生物家族

ICA是淫羊藿中的特征成分，能夠促進OP動物模型中新骨的形成和骨量的增加。ICA體外水解得到淫羊藿次苷Ⅱ，繼續水解得到淫羊藿素，二者都具有與ICA類似的藥理學活性[3]。ICA在體外能夠促進OB增殖、分化和礦化，從而加快骨形成作用，同時能抑制OC增殖，降低OC吸收功能。

2 ICA對OB的作用機制

當前大量實驗結果表明ICA能夠促進大鼠骨髓基質干細胞成骨性分化，增強OB中基質的礦化，具有良好的成骨誘導性[4]。其增強OB活性的同時，還可以抑制OC的分化和骨吸收功能，有較強的促骨形成活性，其雙重作用能夠大大加快骨組織的愈合[5]。

2.1 OB增殖分化的關鍵因子

OB是骨發生和骨形成的物質基礎，也是骨質更新過程中是最重要的功能細胞[6]。在OB增殖分化過程中，細胞因子起著關鍵作用。Wnt經典信號通路與OB增殖密切相關，而β-catenin是其通路中最關鍵的因子之一，能反映OB的增殖[7]。ALP是OB早起分化標志物，在OB增殖期能夠高表達[8]。RUNX2是OB分化必要的特異性轉錄因子，對骨組織的形成和重建起著重要作用。

2.2 ICA對OB中β-catenin表達的影響

β-catenin是Wnt經典信號通路中的關鍵細胞因子，其量的積累是Wnt經典信號通路的關鍵環節。當Wnt經典信號通路啟動時，切斷β-catenin的降解途徑，β-catenin在胞內聚集，入核替換轉錄抑制因子與T細胞因子/淋巴細胞增強子結合因子結合，招募轉錄所需的輔助激活因子，解除抑制，特異激活Wnt下游的靶基因的轉錄和表達，促進細胞的分化增殖。

近幾年來，國內外研究發現Wnt/β-catenin信號通路確實參與了骨形成的過程，ICA能促進Wnt經典通路中關鍵因子β-catenin表達上調，激活下游靶基因的表達，進而促進OB的增殖分化。在體內實驗研究中，發現ICA能上調成骨基因RUNX2表達，抑制OC的活性，增加缺損區骨量，通過經典Wnt/β-catenin途徑，有效地促進骨愈合。不同濃度的ICA能促進Wnt/β-catenin信號通路中關鍵因子的表達，使得β-catenin在胞內聚集，入核激活Wnt經典通路，刺激Wnt下游靶基因的轉錄和表達，進而促進OB的增殖分化[9]。在體外實驗研究中，用含1 μg/mL ICA的培養液培養OB，β-catenin基因表達上調，而加入Wnt/β-catenin抑制劑即DKK1后，β-catenin基因的表達降低，說明Wnt/β-catenin信號通路可能參與了ICA促進OB增殖分化的過程[10]。用不同濃度的ICA干預MC3T3-E1細胞，與ICA和Wnt/β-catenin信號通路抑制劑（Noggin、DKK-1）聯合使用干預MC3T3-E1細胞相比，ICA通過上調Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin的表達，促進MC3T3-E1前OB的成骨分化[11]。最新研究也證實，Wnt經典通路參與了OB的增殖分化，ICA還能促進前OB分化為OB，并且其與知母皂苷或阿魏酸等配伍使用效果更佳。單獨用ICA，知母皂苷或阿魏酸及其組合作用于去雙側卵巢的OP模型，以及培養原代OB，均發現三者組合增強了治療效果，而不增加對OP小鼠的不良影響，協同增加OB增殖，ALP活性和礦化結節形成，并通過調節OB中的骨形態發生蛋白和Wnt/β-catenin信號通路促進骨基質的表達[12]。也有報道ICA可誘導骨髓基質細胞（MSC）的成骨分化，并通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進鈦顆粒誘導的溶骨部位的新骨形成[13]或ICA通過激活ERα-Wnt/β-catenin信號通路促進大鼠MSC的成骨分化[14]。endprint

上述研究均顯示，ICA能通過激活Wnt經典通路，使β-catenin在胞內聚集入核，促進OB的增殖分化。

2.3 ICA對OB中ALP表達的影響

ALP是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經肝臟向外排出的一種酶。ALP不是單一的酶，而是一組同功酶。ALP活性是OB功能及分化程度的指標，是OB早期分化的標志物。ALP在細胞中表達的多少，反映OB的活性，OB處于增殖期時，ALP高表達。

ICA能使ALP高表達，提高其活性，促進OB增殖分化，抑制骨吸收。ICA可以顯著促進鈦顆粒作用下的OB增殖，最佳藥物濃度為10-9 mol/L，并且在此濃度下的ICA可以顯著增加OB中的ALP活性和鈣化結節形成[15]。ICA能顯著上調ALP的表達，促進骨形成，抑制骨吸收，增強ALP活性，提高OB的活力[16]。

此外，也有研究表明ICA對OB的增殖分化沒有顯著影響，甚至以劑量依賴性方式抑制OB增殖，但是ALP活性顯著增強，ICA以劑量依賴性方式抑制OB增殖，最終濃度為1×10-5 mol/L的ICA可顯著增強OB的成骨分化和成熟，表明ICA具有誘導骨形成的活性[17]。不同濃度的ICA培養大鼠的OB，在1×10-5 mol/L的濃度下，對OB的增殖沒有顯著影響，但ALP活性顯著增強[18]。ICA對OB的增殖沒有影響，但改善了ALP活性[19]。ICA增強骨髓基質細胞的成骨分化，但對新生大鼠的顱骨OB的分化沒有影響[20]。

以上研究表明，ICA對OB增殖分化的作用結論尚不一致，但均能增強ALP的活性。

2.4 ICA對OB中RUNX2表達的影響

Runx蛋白是一類轉錄因子蛋白的統稱，其中RU？鄄NX2是OB分化必須的特異轉錄因子，對骨組織的形成和重建起著重要作用。目前已發現適宜劑量的ICA能促進OB的增殖分化，同時能使RUNX2的表達上調[21]。最適濃度的ICA對OB分化和礦化比最佳濃度的地塞米松更有效，RUNX2基因表達水平也更高，濃度在10-5 mol/L時，ICA能使RUNX2基因表達水平更高，更好地促進OB分化和礦化[22]。在體外存在或不存在成骨誘導培養的條件下，用ICA作用于骨髓間充質干細胞，ICA均能促進RUNX2的表達，有利于骨形成作用[23]。

近兩年的研究也表明，RUNX2的表達上調與OB的增殖分化有較大關聯。ICA同樣可以通過上調RUNX2 mRNA表達水平來促進BMSCs向OB的分化[24]，ICA最佳誘導濃度為1×10-6 mol/L，與對照組相比，此濃度下ICA能顯著增加RUNX2的mRNA和蛋白質表達[25]，用不同濃度的ICA干預培養不同時間，ICA對體外培養的大鼠OB增殖并無顯著影響，但可明顯促進OB的分化、上調RUNX2蛋白的表達，并且高濃度ICA抑制OB生長[26]。

上述實驗結果表明，ICA能促進OB的分化，對于其增殖的影響尚有異議，且能上調成骨分化相關基因RUNX2的表達。

3 展望

ICA能促進OB成骨，抑制OC分化與骨吸收，還能促進MSC成骨定向分化，增強機制礦化功能，且相較于其他治療骨質疏松的藥物，ICA具有毒副作用小，來源廣泛，提取工藝簡單，價格低廉，易于儲存的優勢，這些特性有助于其相關新藥的開發。并且ICA還能增加心腦血管血流量、促進造血功能、免疫功能，具有抗衰老、抗腫瘤等功效，治療骨質疏松的同時，可以起到防治其他疾病的作用。

目前，研究均發現ICA能上調β-catenin和RUN？鄄X2的表達，改善ALP活性。ICA對OB增殖分化的影響結論尚不一致，ICA對OB增殖分化沒有影響，甚至以劑量依賴性抑制OB的增殖，對骨形成以及骨吸收的作用機制也尚不明確，但也有研究表明ICA能促進骨形成。實驗結論不一致，有可能是ICA濃度不同，誘導時間不一樣，或者作用的對象不同，從而導致實驗結果的有較大的偏差。因此，還需要進行大量更深入的研究，探討ICA對OB增殖分化是否有效，達到何劑量起效，最適劑量又是多少，以及ICA成骨的分子機制，為開發ICA相關藥物提供依據。

[參考文獻]

[1] 閆景剛，段衛華.骨質疏松癥治療藥物的研究進展[J].中國醫藥導報，2015，12（9）：34-37.

[2] 趙喆，雷鳴，肖德明，等.淫羊藿素成骨機制的研究進展[J].中國骨腫瘤骨病，2010，9（6）：543-547.

[3] 張攀，史娟，劉力，等.淫羊藿苷及其衍生物的抗氧化活性研究[J].中國食品添加劑，2016（2）：85-88.

[4] 郭曉宇，李唯，陳克明，等.淫羊藿苷通過PI3K/AKT-eNOS信號途徑促進大鼠骨髓基質細胞的成骨性分化[J].中國藥理學通報，2013，29（7）：966-970.

[5] 馬小妮，葛寶豐，陳克明，等.淫羊藿苷調節成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收的機制[J].中國醫學科學院學報，2013，35（4）：432-438.

[6] 張靜如，逢丹丹，戴生明.成骨細胞分化及調節過程[J].中華風濕病學雜志，2016，20（7）：486-488.

[7] 賈忠寶，張柳，田發明. Wnt/β-catenin信號通路主要因子與成骨細胞研究進展[J].中國骨質疏松雜志，2012，18（1）：90-94.

[8] 張英，袁月，孫富麗，等.成骨細胞胞內胞外堿性磷酸酶含量比較[J].中國醫科大學學報，2011，40（10）：874-876.

[9] 任翔，吳劍，李嘉航，等.Wnt/β-catenin通路在成骨細胞中的作用[J].現代生物醫學進展，2014，14（25）：4991-4993.

[10] 王冉.Wnt/-βcatenin在淫羊藿苷促成骨細胞增殖分化中的作用[D].北京：首都醫科大學，2014.endprint

[11] 陳旭鳳.淫羊藿苷調控成骨分化的機制研究[D].武漢：華中科技大學，2014.

[12] Li M，Zhang ND，Wang Y，et al. Coordinate regulatory osteogenesis effects of icariin，timosaponin B Ⅱ and ferulic acid from traditional Chinese medicine formulas on UMR-106 osteoblastic cells and osteoblasts in neonatal rat calvaria cultures [J]. J Ethnopharmacol，2016，185：120-131.

[13] Wang J，Tao Y，Ping Z，et al. Icariin attenuates titanium-particle inhibition of bone formation by activating the Wnt/β-catenin signaling pathway in vivo and in vitro [J]. Sci Rep，2016，6：23 827.

[14] Wei Q，Zhang J，Hong G，et al. Icariin promotes osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells by activating the ERα-Wnt/β-catenin signaling pathway [J]. Biomed Pharmacother，2016，84：931-939.

[15] 林綿輝，史占軍.淫羊藿苷對鈦顆粒作用下的成骨細胞增殖和表型的影響[J].實用醫學雜志，2014，30（10）：1548-1551.

[16] Liang W，Lin M，Li X，et al. Icariin promotes bone formation via the BMP-2/Smad4 signal transduction pathway in the hFOB 1.19 human osteoblastic cell line [J]. Int J Mol Med，2012，30（4）：889-895.

[17] 翟遠坤，李志忠，陳克明，等.淫羊藿苷對體外培養乳鼠顱骨成骨細胞增殖、分化及成熟的影響[J].中藥材，2011， 34（6）：917-922.

[18] 明磊國，陳克明，葛寶豐，等.淫羊藿苷與染料木黃酮對體外培養成骨細胞增殖及礦化成熟影響的對比研究[J].中國中藥雜志，2011，36（16）：2240-2245.

[19] 何偉，李自力，崔元璐，等.淫羊藿苷對大鼠成骨細胞核結合因子α1、骨形成蛋白-2、骨形成蛋白-4 mRNA表達的影響[J].北京大學學報：醫學版，2009，41（6）：669-673.

[20] Chen KM，Ma HP，Ge BF，et al. Icariin enhances the osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells but has no effects on the differentiation of newborn calvarial osteoblasts of rats [J]. Pharmazie，2007，62（10）：785-789.

[21] Hsieh TP，Sheu SY，Sun JS，et al. Icariin isolated from Epimedium pubescens regulates osteoblasts anabolism through BMP-2，SMAD4，and Cbfa1 expression [J]. Phytomedicine，2010，17（6）：414-423.

[22] Ma HP，Ming LG，Ge BF，et al. Icariin is more potent than genistein in promoting osteoblast differentiation and mineralization in vitro [J]. J Cell Biochem，2011，112（3）：916-923.

[23] 鮑遠，黃俊明，靖興志，等.淫羊藿苷促進骨髓間充質干細胞成骨分化[J].中國組織工程研究，2016，20（24）：3501-3507.

[24] 傅淑平，楊麗，洪浩，等.淫羊藿苷促SD大鼠骨髓間充質干細胞骨向分化作用的實驗研究[J].中國中西醫結合雜志，2015，35（7）：839-846.

[25] 謝艷芳，王鳴剛，陳克明，等.淫羊藿苷促進膠原水凝膠三維立體培養成骨細胞的成熟分化[J].浙江大學學報：醫學版，2015（3）：301-307.

[26] 李玲慧，丁道芳，杜國慶，等.淫羊藿苷對大鼠成骨細胞增殖及堿性磷酸酶、Runx2蛋白表達的影響[J].中國矯形外科雜志，2013，21（21）：2195-2199.

（收稿日期：2017-03-23 本文編輯：李岳澤）endprint