上轉換發光技術側流免疫夾心法檢測麻風患者和家庭接觸者PGL-I抗體水平

張信輝 楊梨麗 楊 琴 趙廷芳 楊昌明 戴 乾 元 康 翁小滿 溫 艷 Anouk. van Hooij Paul Corstjens Annemieke Geluk 賴雅芳 付 云 李進嵐

麻風分枝桿菌(Mycobacterium Leprae, ML)是麻風的病原體，麻風是嚴重影響人類身心健康的疾病。目前早診斷與早治療依然是控制麻風的基石，涂片查菌陽性率低和缺乏特異性延遲了麻風早期診斷及治療。但因多菌型(MB)麻風患者細胞免疫力缺陷，體液免疫力與正常人接近，而少菌型(PB)與MB相反，造成免疫檢測困難[1]；另 ML 抗原大多與結核分枝桿菌(Mtb)、 非結核分枝桿菌(NTM)有交叉反應，也限制了免疫診斷的發展。目前診斷的麻風病人，通常發現較晚，即使采用了有效的聯合化療(MDT)，依然有相當多的治愈病人因麻風病所致神經損傷而造成畸殘[2]。早期發現并及時治療麻風病，是切斷傳播途徑、減少麻風致殘的先決條件。從麻風患者的家屬(家內接觸者)中監測到臨床極易忽略的早期感染者及潛在的麻風患者十分困難。麻風患者PGL-I血清水平與細菌指數(BI)相關[11]，通過對PGL-I抗體檢測結果的分析，密切監測PGL-I抗體水平的變化，評估發病風險。本研究旨在判斷該實驗對疾病發病的預測價值，并提供一種新的診斷麻風感染的有效診斷方法。

1 材料和方法

1.1 UCP-LFA反應管及檢測試劑由本項目合作單位(荷蘭萊頓大學醫學中心傳染病研究所)Annemieke GelukA教授自主研發[9，10]。項目期間在麻風流行地區采集下列研究對象肝素抗凝全血標本進行UCP-LFA檢測分析：①未服藥的新確診麻風患者(排除復發患者)60例；②患者家屬(與麻風患者共同生活半年以上)87名；③正常人(與麻風患者無共同生活史)56名。

1.2 采集肝素抗凝全血，3 h內分裝在反應管內(每管全血1 mL以上)，即刻放入37℃水浴箱孵育20～24 h，孵育結束后轉存-20℃以下冰箱待檢。

1.3 ①測試前，將反應管內的樣本室溫解凍，4500 g離心10 min。②吸取上清液(4 uL)至96孔稀釋板中(每孔預加200 uL buffer)，避免吸到細胞層，按標本編號順序排列。③將顯色劑(UCP)水浴超聲振蕩器處理后每孔加2 uL；④將PGL-1檢測試紙條(批號：170405)放入稀釋板各樣本孔中，直至試紙條干燥。⑤用LUMC(Leiden University Medical Center)結果判讀儀逐個讀取檢測結果(相對熒光單位 RFUs),并計算T/FC比值以判斷陰陽性。

2 結果

本次研究樣本共203份，其中患者60份，家內接觸者87份，正常對照組56份，檢測失敗2份，有效結果共201份。

2.1 臨界值確定 根據labrox結果判讀儀(LUMC)讀取的檢測值和計算的ROC曲線來確定臨界值。測試線和流量控制線的波峰面積比(R)，Windows下GraphPad Prism version 7.00軟件(GraphPad Software，拉霍亞加利福尼亞，美國)計算Youden指數確定最佳試驗界限(圖1)。經計算將臨界值確定為0.29。

計算ROC曲線(receiver operating characteristic curve)以評估PGL-I的診斷潛力，區分麻風病人、家內接觸者和健康人。PGL-I能區分LL/BL 、BT/TT患者和EC、HHC(圖2)，顯示出對BL/LL患者有極好的顯著性，對BT/TT患者有良好的顯著性(表1)。

表1 曲線下面積的顯著性(AUC)

2.2 PGL-I IgM陽性率

2.2.1 按患者、家內接觸者和正常對照分組，計算PGL-I IgM陽性率，其陽性率分別為81.4%、5.7%和1.8%。患者組PGL-I IgM陽性率明顯高于其余兩組，家內接觸者組PGL-I IgM陽性率又明顯高于正常對照組。三組之間差異有統計學意義(χ2=126.47,P<0.005)，見圖3。

2.2.2 按少菌型(PB)和多菌型(MB)分組計算PGL-I IgM陽性率，其陽性率分別為44.5%和89.4%。MB患者PGL-I IgM陽性率明顯高于PB患者。兩組間差異有統計學意義(χ2=11.181,P<0.005)，見圖4。1例未定型麻風(I)未納入分析。

2.2.3 按BI值陰陽性對患者分組， BI+、BI-患者其PGL-I IgM陽性率分別為83%、0%。BI+ 組PGL-I IgM陽性率明顯高于BI- 組。兩組之間差異有統計學意義(χ2=17.560,P<0.005)，見圖5。

圖1 檢測線(T)一個正信號(a)和一個負信號(b)；流量控制(FC)峰值為內部對照圖2 ROC曲線以評估PGL-I的診斷潛力，區分麻風病人、家內接觸者和健康人圖3 麻風患者、家內接觸者和正常對照分組PGL-I IgM陽性率

圖4 不同型別PGL-I IgM陽性率

圖5 BI值陽性與陰性者的PGL-I IgM陽性率

3 討論

研究結果顯示，患者、家內接觸者、正常對照組PGL-I IgM陽性率分別是81.4%、5.7%和1.8%。患者組PGL-I IgM陽性率明顯高于其余兩組，家內接觸者組PGL-I IgM陽性率又明顯高于正常對照組。三個組別之間的差異有統計學意義(χ2=126.47,P<0.005)。多菌型(MB)PGL-I IgM陽性率(89.4%)明顯高于少菌型(PB)(45.5%)。三個組之間差異有統計學意義(χ2=11.181,P<0.005)。雖然少菌型(BT/TT)患者中檢測IgM類抗體陽性率不高，不能用于人群篩選，但可用于:為治療目的區分MB和PB[4，12]；早期預測復發或發病[4,5]；在高危人群(如家內接觸者)中發現發病危險者。按BI值陰陽性對患者分組， BI+、BI-患者其PGL-I IgM陽性率分別為83%、0%。BI+組PGL-I陽性率明顯高于BI-組，兩個組之間差異有統計學意義(χ2=17.560,P<0.005)，其他學者的研究結果亦表明血抗麻風分枝桿菌IgM類抗體的水平與BI呈線性相關[11]，故在麻風患者家內接觸者中檢出PGL-I IgM抗體水平高的個體，對該個體的發病風險評估具有重要意義。

家內接觸者PGL-I IgM檢測陽性(T/FC比值>0.29)5例(5/87)，其中，3例為父/母子，2例為夫妻，接觸的患者4例為多菌型(BL/LL)、1例為未定型麻風；另有5例家內接觸者PGL-I IgM檢測值偏高(T/FC比值=0.25～0.29),其中，3例為父/母子，1例為夫妻，1例為兄弟，且接觸患者均為多菌型。家內接觸者幾乎與麻風患者共同生活,有極易被感染的環境條件,一些早期發現麻風有家族聚集現象的學者,證實遺傳因素在麻風病學中起到重要作用,由于在這些易感家族中有相同的易感因素和相同的生活環境,故他們患麻風的危險性較無親屬患麻風的人群高[8]。也有研究表明，多菌型接觸者中PGL-I抗體陽性者發病危險性比陰性高8倍以上[3,4,6,7]。故本次篩查發現的5例PGL-I IgM陽性及5例PGL-I IgM檢測值偏高的接觸者，可視為麻風發病危險者，均應密切隨訪[4]，尤其以6例父/母子關系的接觸者為隨訪重點。

55例正常對照組中，1例PGL-I檢測陽性。自述出生于我省麻風流行地區(生活史5年)，家內無明確診斷的麻風患者，應密切隨訪。

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