琚灣酸漿面漿水細菌多樣性評價

周書楠,席修璞,董 蘊,葉萬海,張振東,郭 壯*

(1.湖北文理學院 化學工程與食品科學學院 鄂西北傳統發酵食品研究所,湖北 襄陽 441053；2.襄陽市食品藥品監督管理局,湖北 襄陽 441021)

作為中國地理標識產品和湖北省非物質文化遺產,湖北省棗陽市琚灣酸漿面以漿水、精制面條和香辣臊子等為主要成分,運用傳統技藝加工制作而成。漿水是酸漿面品質形成的關鍵,一方面賦予了酸漿面獨特的酸味,另一方面其浸泡發酵的芹菜亦是酸漿面中的佐料。漿水的制作環境較為開放,為了消除腐敗菌的污染,通常會向前日剩余的漿水中加入等體積的沸水,并放置8～10 h后使用。經走訪調研發現,酸漿面的制作和食用通常在每年的7～10月份,究其原因可能在于其他月份溫度過低不利于微生物的發酵,從而無法制得漿水。在解析微生物群落結構的基礎上,對漿水中優勢菌群進行分離、鑒定、保藏和篩選,繼而采用高密度發酵技術和冷凍干燥技術相結合的手段進行直投式發酵劑制備,同時輔以適宜的溫度,可能對實現琚灣酸漿面的全天候乃至工業化生產具有積極意義。由此可見,對琚灣酸漿面漿水細菌多樣性展開評價是極為必要的。

近年來興起的Miseq高通量測序技術不僅具有通量高的優點[1],同時實現了多樣本微生物群落結構的平行分析與評價[2],在酸奶[3]、臘腸[4]、葡萄酒[5]、窖泥[6]和泡菜[7]等發酵食品的微生物多樣性研究中有著廣泛的應用,為評價琚灣酸漿面漿水中細菌多樣性提供了新的思路和技術手段。除此之外,在獲取細菌16S rRNA序列信息的基礎上,使用KOMODO(Known Media Database)等網站[8]對優勢菌培養基的配方進行預測,對后續漿水中優勢微生物菌株的分離亦可能具有積極的意義。

本項目以琚灣酸漿面漿水為研究對象,采用Miseq高通量測序技術對其細菌多樣性進行了評價,同時結合生物信息學和多元統計學手段對微生物群落結構進行了平行分析。通過本研究的實施,以期全面解析酸漿面漿水中細菌的多樣性,為后續琚灣酸漿面的全年化生產提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙二胺四乙酸二鈉、異戊醇、氯仿、醋酸鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)飽和酚、乙醇、三羥甲基氨基甲烷、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉:國藥集團化學試劑有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit:德國QIAGEN公司；脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)、蛋白酶K、5×TransStartTM、FastPfu Buffer和FastPfu Fly DNA Polymerase:北京全式金生物技術有限公司；聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)緩沖液:寶生物工程(大連)有限公司；338F/806R引物,其中正向引物中加入7個核苷酸標簽(barcode):由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設備

5810R臺式高速冷凍離心機:德國Eppendorf公司；DYY-12電泳儀:北京六一儀器廠；Vetiri梯度基因擴增儀:美國AB公司；Miseq高通量測序平臺:美國Illumina公司；R920機架式服務器:美國DELL公司；ND-2000C微量紫外分光光度計:美國Nano Drop公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統:美國BIO-RAD公司；2100芯片生物分析儀:美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集

從湖北省棗陽市琚灣鎮采集10個酸漿面漿水樣品,漿水裝入采樣瓶中,置于含有冰袋的采樣箱中低溫運送回實驗室,12 h內完成脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取工作。

1.3.2 DNA提取

50 mL漿水400 r/min離心10 min去除蔬菜殘渣后,取上清液10 000 r/min繼續離心10 min,使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒對離心后得到的菌泥進行微生物總DNA提取。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶明亮且無彌散現象,OD260nm/280nm在1.8～2.0且質量濃度＞10 ng/μL的DNA樣品置-20℃備用。

1.3.3 細菌16S rRNA聚合酶鏈式反應擴增及Miseq高通量測序

擴增體系為20 μL:10×PCR緩沖液4 μL,2.5 mmol/L dNTP2μL,5μmol/L正向和反向引物各0.8μL,5U/μLDNA聚合酶0.4 μL,DNA模板10 ng,其余部分為ddH2O。

擴增條件為:95℃變性3 min；95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30個循環；72℃延伸10 min。檢測合格的PCR擴增產物稀釋至100 nmol/L后,使用干冰寄往上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Miseq高通量測序。

1.3.4 序列的拼接及質控

在序列進行拼接過程中同時進行質控,若成對序列重疊區堿基數＜10 bp、最大錯配比率＞0.2、barcode存在堿基錯配或引物堿基錯配數＞2 bp的序列均會予以剔除。將切除barcode和引物后的序列,合并為一個fna文件進行后續的生物信息學分析。

1.3.5 生物信息學分析

使用QIIME分析平臺[9]結合已建立的腳本程序對1.3.4生成的fna文件進行序列的生物信息學分析:在使用Py-NAST[10]對序列校準排齊的基礎上,進一步使用兩步UCLUST法[11]歸并建立分類操作單元(operational taxonomic units,OTU)；從各OTU中選取代表性序列,使用RDP(Ribosomal Database Project,Release 11.5)[12]和Greengenes(Release 13.8)[13]數據庫對序列進行同源性比對,通過對數據的整合進而明確其種屬分類學地位；使用FastTree軟件[14]構建系統發育進化樹,進而對酸漿面漿水的Chao 1指數和Shannon指數等α多樣性指標進行計算。

1.3.6 核酸登錄號

本研究中所有序列數據已提交至MG-RAST數據庫,ID號為mgp82912。

1.3.7 多元統計學分析

使用基于分類操作單元加權UniFrac距離的非加權組平均法(unweighted pair group method using arithmetic average,UPGMA)聚類對樣品進行聚類分析,使用基于非加權UniFrac距離的主坐標分析法(principal coordinate analysis,PCoA)對樣品進行空間排布,使用多元方差分析(multivariateanalysis of variance,MANOVA)對隸屬于不同聚類樣品間微生物群落結構的顯著性進行分析,使用歐式距離對不同聚類樣品間微生物群落結構的平均距離進行計算,使用冗余分析(redundancy analysis,RDA)對導致樣品形成2個聚類的OTU進行甄別。使用Mega7.0(http://www.megasoftware.net/)進行系統發育樹繪制,使用Origin 8.5軟件和Matlab 2010b軟件進行其他圖的繪制。

2 結果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

納入本研究的10個酸漿面漿水樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數量如表1所示。

由表1可知,10個酸漿面漿水樣品共產生了388 306條高質量16S rRNA序列,平均每個樣品產生38 831條。本研究采用兩步UCLUST歸并法建立了分類操作單元,其中采用100%相似性聚類得到了129 865條代表性序列,在此基礎上根據97%相似性聚類進一步得到了7 014個OTU,平均每個樣品1 100個。由表1可知,樣品X3具有最大的細菌微生物豐度,其Chao 1指數為4 282,而X6樣品細菌微生物多樣性最高,其Shannon指數高達6.63。

表1 樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數量Table 1 16S rRNA sequencing conditions and number of taxonomical levels

2.2 基于不同分類地位細菌菌群相對含量的分析

本研究產生的388306條序列,經同源性比對后,將其鑒定為11個門,20個綱,26個目,45個科和61個屬,僅有0.036%的序列不能鑒定到屬水平,其中有99.72%的細菌隸屬于硬壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。由此可見,琚灣酸漿面漿水中的細菌幾乎全部為乳酸桿菌。在得到7020個OTU的基礎上,本研究進一步對平均相對含量＞1.0%的OTU相對含量進行了分析,其結果如圖1所示。

圖1 酸漿面漿水樣品中相對含量＞1.0%的OTUFig.1 OTU with relative abundance more than 1.0%in Suanjiangmian Jiangshuisamples

由圖1可知,酸漿面漿水中平均相對含量＞1.0%的OTU包括OTU6714、OTU2729、OTU3444、OTU3502、OTU6031、OTU1714、OTU5237和OTU3119,8個OTU的累計平均相對含量高達63.79%。以Illumina MiSeq為代表的二代測序技術具有讀數短的缺點,其無法完成16S rRNA的全長測序,因而為了保證結果的可靠性,一般僅在分類學地位“屬”及以上水平對微生物的分類學地位進行確定。本研究進一步選取了8個平均相對含量＞1.0%的OTU中的代表性序列,構建了系統發育樹,其結果如圖2所示。

圖2 相對含量＞1.0%OTU的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of OTU with relative abundance more than 1.0%

由圖2可知,雖然不能將OTU鑒定到種水平,但OTU6031、OTU1714、OTU3444和OTU3502可以與德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)形成一個聚類,OTU6714與嗜淀粉乳桿菌(L.amylolyticus)形成一個聚類,OTU2729可以與干酪乳桿菌(L.casei)和副干酪乳桿菌(L.paracasei)形成一個聚類,OTU3119可以與口乳桿菌(L.oris)形成一個聚類。如果一個OTU在10個酸漿面漿水樣品中均存在,則將其定義為核心OTU。本研究進一步統計了OTU在10個酸漿面漿水樣品中出現的次數,其結果如圖3所示。

圖3 OTU在10個樣品中出現次數統計Fig.3 Occurrence frequency statistics of OTU in 10 samples

由圖3可知,10個樣品共有18個核心OTU,雖然僅占OTU總數的0.26%,但其包含了212 778條序列,占所有質控后合格序列數的54.80%。此外,在10個樣品中出現9次、8次、7次和6次的OTU各有23個、39個、57個和99個,分別占OTU總數的0.33%、0.56%、0.81%和1.41%,4類OTU共包含95 555條序列,占所有質控后合格序列數的24.61%。雖然在10個樣品中僅出現1次的OTU多達5 435個,占到OTU總數的77.49%,但其僅包含12 967條序列,平均每個OTU包含2.4條序列。由此可見,在OTU水平上,10個酸漿面漿水樣品共有大量的細菌類群,其累計平均相對含量達到54.80%。本研究進一步對18個核心OTU進行了分析,其在各酸漿面漿水樣品中相對含量的熱圖如圖4所示。

圖4 核心OTU在各樣品中相對含量的熱圖Fig.4 Heat map of the relative contents of core OTUs in 10 samples

由圖4可知,18個核心OTU均隸屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus),除OTU6714的平均相對含量達45.70%外,其他核心OTU的平均相對含量均＜1.0%。值得一提的是,不同樣品中OTU6714的含量亦存在較大的差異,其在X3、X7和X9樣品中達87%,而在X5和X8樣品中的含量均＜0.01%。2.3酸漿面漿水細菌菌群群落結構的研究

在對酸漿面漿水中不同分類地位細菌菌群相對含量進行分析的基礎上,本研究進一步采用UPGMA聚類分析和主坐標分析對其細菌菌群群落結構進行了研究,基于分類操作單元加權UniFrac距離的UPGMA聚類分析如圖5所示。

圖5 基于分類操作單元加權UniFrac距離的UPGMA聚類分析Fig.5 UPGMA clustering analysis of OTUs based on weighting UniFrac distance

由圖5可知,10個樣品整體上可以分為2個聚類,其中聚類I由樣品X3、X4、X7、X9和X10構成,聚類II由樣品X1、X2、X5、X6和X8構成。由此可見,雖然若干酸漿水樣品存在大量的核心細菌菌群,但某些樣品間微生物的群落結構存在較大的差異。本研究進一步使用基于非加權UniFrac距離的主坐標分析對10個樣品的空間排布進行了研究,結果如圖6所示。

圖6 基于分類操作單元加權UniFrac距離的主坐標分析Fig.6 Principal coordinate analysis of OTUs based on weighting UniFrac distance

由圖6可知,隸屬于不同聚類的酸漿面漿水樣品在空間排布上呈現出明顯的分離趨勢,這進一步證實了隸屬于聚類I和聚類II的樣品其微生物群落結構構成存在較大的差異,通過MANOVA驗證發現兩者差異極顯著(P＜0.001)。值得一提的是,本研究進一步采用歐式距離對兩個聚類樣品間微生物群落結構的平均距離進行了計算,結果發現隸屬于聚類I的樣品組間平均距離為0.825±0.020,而聚類II為0.815±0.025,經顯著性分析發現兩者差異不顯著(P＞0.05)。

雖然隸屬于不同聚類的酸漿面漿水其微生物群落結構明顯不同,然而究竟是由于那些OTU不同導致了該現象的發生是本研究亟待解決的問題。通過設置聚類I/聚類II作為起約束作用的解釋變量,本研究進一步使用RDA用于預測和解釋全部平均含量＞1.0%的OTU數據組成的響應變量,從而對能顯著解釋不同聚類間酸漿面漿水細菌微生物群落結構存在差異的最小變量組合進行確定[15]。經分析發現,數據中有19.3%的變異度能夠被聚類I/聚類II分組所解釋,而通過蒙特卡羅置換檢驗發現這一約束因素具有顯著性(P=0.024)。RDA雙序圖如圖7所示。

圖7 冗余分析雙序圖Fig.7 Biplot of the redundancy analysis

由圖7可知,在平均相對含量＞1.0%的OTU中,OTU6714和OTU1714與RDA排序圖約束軸上的樣本賦值良好相關,2個OTU均隸屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。由此可見,正是由于上述2個OTU在不同樣品中的分布及含量不同,進而導致了隸屬于聚類I和聚類II的樣品其微生物群落結構明顯不同。由圖7可知,在RDA排序圖中OTU6714位于圖的右側(即聚類I)而OTU1714位于圖的左側(即聚類II),這說明OTU6714的相對含量在隸屬于聚類I的樣品中較高,而OTU1714呈現出相反的趨勢,通過Mann-Whitney驗證發現2個OTU在不同聚類的酸漿面漿水樣品間差異非常顯著(P＜0.01)。

3 結論

在進行微生物基因組DNA提取的基礎上,本研究使用高通量測序技術,對琚灣酸漿面這一中國地理標識產品的漿水細菌多樣性進行了評價。結果發現,琚灣酸漿面漿水中的細菌微生物中乳酸桿菌相對含量達99.72%,雖然不同樣品共有54.80%的核心細菌類群,但由于部分乳酸桿菌屬細菌的不同導致其可以劃分為兩個聚類,且隸屬于不同聚類的樣品細菌群落結構存在顯著的差異。通過本研究的開展,可為后續酸漿面漿水用發酵劑的制備提供一定理論參考,進而使酸漿面的全年化生產成為可能。

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