寧夏玉泉營地區釀酒葡萄酵母菌的分離篩選及分子鑒定

王志恒,馮翠娥,王 沖,羅 慧,鄒 芳,劉雅琴*,魏玉清

(1.北方民族大學 生物科學與工程學院 發酵釀造工程生物技術國家民委重點實驗室 寧夏葡萄與葡萄酒技術創新中心,寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學 生命科學學院,寧夏 銀川 750021)

寧夏玉泉營位于賀蘭山東麓、黃河岸邊,隸屬于我國著名的優質葡萄產區之一的賀蘭山東麓葡萄產區,該產區與美國的納帕谷葡萄酒產區以及法國的波爾多葡萄酒產區都處于同一緯度,是適合優質釀酒葡萄生長發育的北緯38°。20世紀80年代,玉泉營開始大面積種植鮮食和釀酒葡萄。經過三十多年的努力,現在玉泉營地區葡萄種植面積已達10萬畝,是全區最大的釀酒葡萄種植基地。在此期間玉泉營葡萄獲得國家“綠色食品”稱號、自治區“三個十工程”的葡萄基地、國家八部委確定其為國家級農業產業化龍頭企業、“賀蘭山東麓葡萄酒原產地域”、國家首批的“工農業生態旅游示范點”等。現如今,玉泉營地區分布著巴格斯、西夏王等著名酒莊,是寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產區的中心地帶,該地區的生態條件與世界著名的葡萄產地波爾多地區相比,也具有一定優勢[1-3]。

酵母菌是使一些糖類物質進行降解的各種單細胞真菌,在目前的分類地位上酵母菌還沒有一個規定的標準[4-9]。酵母菌在葡萄酒釀造過程中的作用十分重要[10],它不僅對于葡萄酒的酒精產量有決定性作用,也對葡萄酒的品質有著深刻影響[11]。釀酒大師在釀造葡萄酒時,為了發揮出葡萄的全部能量來提升葡萄酒的整體品質,會特別注重釀酒酵母菌的選擇,優良品質的酵母菌是葡萄酒品質的必不可少條件之一[12]。目前我國的葡萄酒產業發展日新月異,但在葡萄酒酵母研究方面已經和葡萄酒產業規模的差距越拉越大,現如今國內大部分葡萄酒廠所使用的酵母菌大多是國外的商業酵母,此種酵母的大量使用會使葡萄酒釀造過程中本土酵母失去發酵主導地位,這樣就會導致釀造出的葡萄酒風格單一,體現不出產區特色[13]。隨著社會的發展,國人對于葡萄酒品質要求愈來愈高,同時葡萄酒的釀造技藝和風味深刻影響葡萄酒品質,因此精確分類酵母菌對于提高葡萄酒質量具有一定的研究價值[14]。

本研究對寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產區的核心地區——玉泉營中的釀酒葡萄進行菌株分離,使用WL培養基進行初步聚類分析,通過26S rDNA D1/D2序列分析進行菌株鑒定,確認分類地位,進而初步確定寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄產區酵母菌的主要種類,為葡萄酒產區酵母菌的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

從寧夏玉泉營葡萄園的土壤、成熟度好的釀酒葡萄漿果以及釀酒葡萄自然發酵的不同時期的自然發酵醪中分離酵母菌株。

1.1.2 化學試劑

酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨(均為生化試劑):北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鐵、硫酸錳、溴甲酚綠(均為分析純):天津大茂化學試劑廠。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YEPD)培養基[14]:葡萄糖20g/L,酵母浸粉10g/L,瓊脂20g/L,蛋白胨20 g/L,自然pH,121℃高壓蒸汽滅菌20 min左右。

WL營養瓊脂培養基[15]:酵母浸粉4g/L,氯化鐵0.0025g/L,胰蛋白胨5 g/L,硫酸鎂0.125 g/L,葡萄糖5 g/L,瓊脂20 g/L,氯化鈣0.125g/L,硫酸錳0.002 g/L,磷酸二氫鉀0.055 g/L,溴甲酚綠0.022 g/L,氯化鉀0.425 g/L,pH值為6.5左右,121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

APOLLO型PCR儀:美國伯樂公司；DYCP-31B瓊脂糖凝膠電泳系統:北京六一儀器廠；SHP-250生化培養箱:上海森信試驗儀器有限公司；酵母基因提取試劑盒:康為世紀生物科技公司；BIO-RAD凝膠成像系統:美國伯樂公司；JA5003B電子天平:上海精科天美科學儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株分離

(1)將采集好的成熟葡萄10粒,搗碎后置于0.9%無菌生理鹽水中,完全振蕩成菌懸液,將其梯度稀釋涂布接種于YEPD固體培養基28℃培養24～72 h。

(2)采用五點取樣法采集葡萄園土壤,將土壤置于0.9%無菌生理鹽水中,完全振蕩成菌懸液,將其梯度稀釋涂布接種于YEPD固體培養基28℃培養12～72 h。

(3)選取成熟度較好的葡萄樣品進行人工破碎,將破碎后的葡萄進行自然發酵。觀察自然發酵過程,依次于葡萄自然發酵的前、中、后期取1 mL發酵液置于0.9%無菌生理鹽水,完全振蕩成菌懸液,將其梯度稀釋涂布接種于YEPD固體培養基28℃培養24～72 h。

1.3.2 菌株WL培養基聚類分析

將保藏的酵母菌株使用YEPD液體培養基進行活化,振蕩培養24～72 h,吸取0.1 mL培養完全的菌液于試管中,采用稀釋涂布法接種于WL培養基上,28℃倒置培養72～144 h后,觀察并記錄菌落形態特征[15]。

1.3.3 菌株DNA提取

酵母菌脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取方法參照酵母基因提取試劑盒說明,提取后置于-20℃冰箱保藏備用。

1.3.4 PCR擴增與測序分析

聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增所需引物參考劉愛國等[16]的實驗方法,PCR擴增程序參考王國平等[14]的實驗方法。然后將PCR結果通過瓊脂糖凝膠電泳檢測目標產物。最終將PCR產物交由昆泰銳(武漢)生物技術有限責任公司進行純化和測序。將得到的7個序列進行校正后提交至美國國家生物技術信息中心(national centerofbiotechnologyinformation,NCBI),在GenBank核酸序列數據庫中進行同源序列搜索(basiclocalalignmentsearch tool,BLAST),采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)模型進行進化樹構建[14]。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選與初步聚類分析

對分別從葡萄漿果、葡萄自然發酵的不同時期以及葡萄園土壤中初步分離出來的菌株進行YEPD固體培養基篩選,在自然發酵過程中分離酵母菌株共18株(前期10株、中期6株、后期2株),從葡萄園土壤中分離1株,從葡萄漿果分離3株,共分離出22株酵母菌株,部分酵母菌株的菌落形態見圖1。由圖1可知,菌株的菌落形態特征為表面光滑,不透明,菌落呈卵圓形。

圖1 部分分離酵母菌株的菌落形態Fig.1 Colonial morphology of some isolated yeast strains

將篩選出的酵母菌株在WL培養基上進行培養,分離酵母菌株所形成的菌落特征結果見表1。由表1可知,22株酵母菌株經過WL培養基的培養后,依據菌落顏色及形態特征可分為6種類型。

上述分離酵母菌株所形成的菌落特征與CAVAZZA A等[17-18]的研究結果進行對比,結果見圖2。由圖2可知,分離酵母菌株大致分為6個類型,菌落類型Ⅰ為克魯維畢赤酵母(Pichiakluyveri)；菌落類型Ⅱ為美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)；菌落類型Ⅲ為葡萄酒有孢漢生酵母(Hanseniaspora vineae)；菌落類型Ⅳ為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；菌落類型Ⅴ為大隱球酵母(Cryptococcus magnus)；菌落類型Ⅵ未能鑒定出。

表1 分離酵母菌株在WL培養基上的菌落形態Table 1 Colony morphology of isolated yeast strains on WL medium

圖2 分離酵母菌株在WL培養基上的初步聚類分析結果Fig.2 Results of preliminary cluster analysis of isolated yeast strains on WL medium

2.2 酵母菌的分子生物學鑒定

圖3 分離酵母菌株26S rDNA D1/D2序列擴增電泳結果Fig.3 Amplification electrophoresis results of 26S rDNA D1/D2 sequence of isolated yeast strains

依據分離酵母菌在WL培養基上的初步聚類分析結果,參考劉愛國等[16]的實驗方法及各類型酵母菌株在培養時期的生長情況和菌落特征,從6種菌落類型中選出具有代表性的6株酵母菌(Q-02、Q-03、Z-01、H-01、T-01、Z-06)進行26S rDNA D1/D2序列擴增,菌株擴增后的電泳結果見圖3。由圖3可知,各菌株PCR擴增引物大小為500～700 bp。

將目標產物送往武漢昆泰銳生物技術有限責任公司進行測序。最后將測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST search[19]。得到菌株鑒定結果。

2.3 系統發育分析

對6株菌株的基因序列進行擴增,共獲得6個序列。選擇同源性匹配最高的菌株作為參照,下載序列文件,然后進行ClusterW序列多重比對,采用鄰接法模型進行進化樹構建,bootstrap method設為1000,構建結果見圖4。

圖4 6株供試菌株基于26S rDNA D1/D2區序列的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 6 tested strains based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence

由圖4可知,在系統發育樹上,菌株Z-01與葡萄酒有孢漢生酵母(Hanseniaspora vineae)親緣關系最近,序列的相似度為99.5%。菌株H-01與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)序列的相似度為99.6%,說明它們親緣關系很近。菌株Q-02與克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)序列的相似度為100%,可以確定菌株Q-02是克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)。菌株Q-03與美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)序列的相似度為99.9%。菌株T-01與大隱球酵母(Cryptococcus magnus)序列的相似度為100%,說明菌株T-01為大隱球酵母(Cryptococcus magnus)。菌株Z-06與東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)序列的相似度為99.8%,說明它們的親緣關系很近。

3 結論

本研究共分離篩選出酵母菌株22株,通過初步聚類分析,可將所分離到的酵母菌分為6種類型。依據分類結果,選出具有代表性的酵母菌株,結合26S rDNA D1/D2區序列分析,鑒定結果表明,6種酵母菌株依次為克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)、美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、葡萄酒有孢漢生酵母(Hanseniaspora vineae)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大隱球酵母(Cryptococcus magnus)、東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)。

本研究結果為寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產區酵母菌分離篩選奠定基礎,有關該產區酵母菌的發酵特性及其進一步利用仍需繼續研究。

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