寧夏玉泉營(yíng)地區(qū)釀酒葡萄酵母菌的分離篩選及分子鑒定

王志恒,馮翠娥,王 沖,羅 慧,鄒 芳,劉雅琴*,魏玉清

(1.北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院 發(fā)酵釀造工程生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧夏葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心,寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

寧夏玉泉營(yíng)位于賀蘭山東麓、黃河岸邊,隸屬于我國(guó)著名的優(yōu)質(zhì)葡萄產(chǎn)區(qū)之一的賀蘭山東麓葡萄產(chǎn)區(qū),該產(chǎn)區(qū)與美國(guó)的納帕谷葡萄酒產(chǎn)區(qū)以及法國(guó)的波爾多葡萄酒產(chǎn)區(qū)都處于同一緯度,是適合優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄生長(zhǎng)發(fā)育的北緯38°。20世紀(jì)80年代,玉泉營(yíng)開始大面積種植鮮食和釀酒葡萄。經(jīng)過三十多年的努力,現(xiàn)在玉泉營(yíng)地區(qū)葡萄種植面積已達(dá)10萬畝,是全區(qū)最大的釀酒葡萄種植基地。在此期間玉泉營(yíng)葡萄獲得國(guó)家“綠色食品”稱號(hào)、自治區(qū)“三個(gè)十工程”的葡萄基地、國(guó)家八部委確定其為國(guó)家級(jí)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化龍頭企業(yè)、“賀蘭山東麓葡萄酒原產(chǎn)地域”、國(guó)家首批的“工農(nóng)業(yè)生態(tài)旅游示范點(diǎn)”等。現(xiàn)如今,玉泉營(yíng)地區(qū)分布著巴格斯、西夏王等著名酒莊,是寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的中心地帶,該地區(qū)的生態(tài)條件與世界著名的葡萄產(chǎn)地波爾多地區(qū)相比,也具有一定優(yōu)勢(shì)[1-3]。

酵母菌是使一些糖類物質(zhì)進(jìn)行降解的各種單細(xì)胞真菌,在目前的分類地位上酵母菌還沒有一個(gè)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)[4-9]。酵母菌在葡萄酒釀造過程中的作用十分重要[10],它不僅對(duì)于葡萄酒的酒精產(chǎn)量有決定性作用,也對(duì)葡萄酒的品質(zhì)有著深刻影響[11]。釀酒大師在釀造葡萄酒時(shí),為了發(fā)揮出葡萄的全部能量來提升葡萄酒的整體品質(zhì),會(huì)特別注重釀酒酵母菌的選擇,優(yōu)良品質(zhì)的酵母菌是葡萄酒品質(zhì)的必不可少條件之一[12]。目前我國(guó)的葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展日新月異,但在葡萄酒酵母研究方面已經(jīng)和葡萄酒產(chǎn)業(yè)規(guī)模的差距越拉越大,現(xiàn)如今國(guó)內(nèi)大部分葡萄酒廠所使用的酵母菌大多是國(guó)外的商業(yè)酵母,此種酵母的大量使用會(huì)使葡萄酒釀造過程中本土酵母失去發(fā)酵主導(dǎo)地位,這樣就會(huì)導(dǎo)致釀造出的葡萄酒風(fēng)格單一,體現(xiàn)不出產(chǎn)區(qū)特色[13]。隨著社會(huì)的發(fā)展,國(guó)人對(duì)于葡萄酒品質(zhì)要求愈來愈高,同時(shí)葡萄酒的釀造技藝和風(fēng)味深刻影響葡萄酒品質(zhì),因此精確分類酵母菌對(duì)于提高葡萄酒質(zhì)量具有一定的研究?jī)r(jià)值[14]。

本研究對(duì)寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的核心地區(qū)——玉泉營(yíng)中的釀酒葡萄進(jìn)行菌株分離,使用WL培養(yǎng)基進(jìn)行初步聚類分析,通過26S rDNA D1/D2序列分析進(jìn)行菌株鑒定,確認(rèn)分類地位,進(jìn)而初步確定寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)酵母菌的主要種類,為葡萄酒產(chǎn)區(qū)酵母菌的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

從寧夏玉泉營(yíng)葡萄園的土壤、成熟度好的釀酒葡萄漿果以及釀酒葡萄自然發(fā)酵的不同時(shí)期的自然發(fā)酵醪中分離酵母菌株。

1.1.2 化學(xué)試劑

酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨(均為生化試劑):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鐵、硫酸錳、溴甲酚綠(均為分析純):天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YEPD)培養(yǎng)基[14]:葡萄糖20g/L,酵母浸粉10g/L,瓊脂20g/L,蛋白胨20 g/L,自然pH,121℃高壓蒸汽滅菌20 min左右。

WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[15]:酵母浸粉4g/L,氯化鐵0.0025g/L,胰蛋白胨5 g/L,硫酸鎂0.125 g/L,葡萄糖5 g/L,瓊脂20 g/L,氯化鈣0.125g/L,硫酸錳0.002 g/L,磷酸二氫鉀0.055 g/L,溴甲酚綠0.022 g/L,氯化鉀0.425 g/L,pH值為6.5左右,121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

APOLLO型PCR儀:美國(guó)伯樂公司；DYCP-31B瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng):北京六一儀器廠；SHP-250生化培養(yǎng)箱:上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；酵母基因提取試劑盒:康為世紀(jì)生物科技公司；BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng):美國(guó)伯樂公司；JA5003B電子天平:上海精科天美科學(xué)儀器公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離

(1)將采集好的成熟葡萄10粒,搗碎后置于0.9%無菌生理鹽水中,完全振蕩成菌懸液,將其梯度稀釋涂布接種于YEPD固體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24～72 h。

(2)采用五點(diǎn)取樣法采集葡萄園土壤,將土壤置于0.9%無菌生理鹽水中,完全振蕩成菌懸液,將其梯度稀釋涂布接種于YEPD固體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)12～72 h。

(3)選取成熟度較好的葡萄樣品進(jìn)行人工破碎,將破碎后的葡萄進(jìn)行自然發(fā)酵。觀察自然發(fā)酵過程,依次于葡萄自然發(fā)酵的前、中、后期取1 mL發(fā)酵液置于0.9%無菌生理鹽水,完全振蕩成菌懸液,將其梯度稀釋涂布接種于YEPD固體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24～72 h。

1.3.2 菌株WL培養(yǎng)基聚類分析

將保藏的酵母菌株使用YEPD液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化,振蕩培養(yǎng)24～72 h,吸取0.1 mL培養(yǎng)完全的菌液于試管中,采用稀釋涂布法接種于WL培養(yǎng)基上,28℃倒置培養(yǎng)72～144 h后,觀察并記錄菌落形態(tài)特征[15]。

1.3.3 菌株DNA提取

酵母菌脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取方法參照酵母基因提取試劑盒說明,提取后置于-20℃冰箱保藏備用。

1.3.4 PCR擴(kuò)增與測(cè)序分析

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增所需引物參考劉愛國(guó)等[16]的實(shí)驗(yàn)方法,PCR擴(kuò)增程序參考王國(guó)平等[14]的實(shí)驗(yàn)方法。然后將PCR結(jié)果通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物。最終將PCR產(chǎn)物交由昆泰銳(武漢)生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行純化和測(cè)序。將得到的7個(gè)序列進(jìn)行校正后提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(national centerofbiotechnologyinformation,NCBI),在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索(basiclocalalignmentsearch tool,BLAST),采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)模型進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選與初步聚類分析

對(duì)分別從葡萄漿果、葡萄自然發(fā)酵的不同時(shí)期以及葡萄園土壤中初步分離出來的菌株進(jìn)行YEPD固體培養(yǎng)基篩選,在自然發(fā)酵過程中分離酵母菌株共18株(前期10株、中期6株、后期2株),從葡萄園土壤中分離1株,從葡萄漿果分離3株,共分離出22株酵母菌株,部分酵母菌株的菌落形態(tài)見圖1。由圖1可知,菌株的菌落形態(tài)特征為表面光滑,不透明,菌落呈卵圓形。

圖1 部分分離酵母菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of some isolated yeast strains

將篩選出的酵母菌株在WL培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),分離酵母菌株所形成的菌落特征結(jié)果見表1。由表1可知,22株酵母菌株經(jīng)過WL培養(yǎng)基的培養(yǎng)后,依據(jù)菌落顏色及形態(tài)特征可分為6種類型。

上述分離酵母菌株所形成的菌落特征與CAVAZZA A等[17-18]的研究結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果見圖2。由圖2可知,分離酵母菌株大致分為6個(gè)類型,菌落類型Ⅰ為克魯維畢赤酵母(Pichiakluyveri)；菌落類型Ⅱ?yàn)槊罉O梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)；菌落類型Ⅲ為葡萄酒有孢漢生酵母(Hanseniaspora vineae)；菌落類型Ⅳ為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；菌落類型Ⅴ為大隱球酵母(Cryptococcus magnus)；菌落類型Ⅵ未能鑒定出。

表1 分離酵母菌株在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Table 1 Colony morphology of isolated yeast strains on WL medium

圖2 分離酵母菌株在WL培養(yǎng)基上的初步聚類分析結(jié)果Fig.2 Results of preliminary cluster analysis of isolated yeast strains on WL medium

2.2 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

圖3 分離酵母菌株26S rDNA D1/D2序列擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.3 Amplification electrophoresis results of 26S rDNA D1/D2 sequence of isolated yeast strains

依據(jù)分離酵母菌在WL培養(yǎng)基上的初步聚類分析結(jié)果,參考劉愛國(guó)等[16]的實(shí)驗(yàn)方法及各類型酵母菌株在培養(yǎng)時(shí)期的生長(zhǎng)情況和菌落特征,從6種菌落類型中選出具有代表性的6株酵母菌(Q-02、Q-03、Z-01、H-01、T-01、Z-06)進(jìn)行26S rDNA D1/D2序列擴(kuò)增,菌株擴(kuò)增后的電泳結(jié)果見圖3。由圖3可知,各菌株P(guān)CR擴(kuò)增引物大小為500～700 bp。

將目標(biāo)產(chǎn)物送往武漢昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。最后將測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST search[19]。得到菌株鑒定結(jié)果。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)6株菌株的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增,共獲得6個(gè)序列。選擇同源性匹配最高的菌株作為參照,下載序列文件,然后進(jìn)行ClusterW序列多重比對(duì),采用鄰接法模型進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建,bootstrap method設(shè)為1000,構(gòu)建結(jié)果見圖4。

圖4 6株供試菌株基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 6 tested strains based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence

由圖4可知,在系統(tǒng)發(fā)育樹上,菌株Z-01與葡萄酒有孢漢生酵母(Hanseniaspora vineae)親緣關(guān)系最近,序列的相似度為99.5%。菌株H-01與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)序列的相似度為99.6%,說明它們親緣關(guān)系很近。菌株Q-02與克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)序列的相似度為100%,可以確定菌株Q-02是克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)。菌株Q-03與美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)序列的相似度為99.9%。菌株T-01與大隱球酵母(Cryptococcus magnus)序列的相似度為100%,說明菌株T-01為大隱球酵母(Cryptococcus magnus)。菌株Z-06與東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)序列的相似度為99.8%,說明它們的親緣關(guān)系很近。

3 結(jié)論

本研究共分離篩選出酵母菌株22株,通過初步聚類分析,可將所分離到的酵母菌分為6種類型。依據(jù)分類結(jié)果,選出具有代表性的酵母菌株,結(jié)合26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析,鑒定結(jié)果表明,6種酵母菌株依次為克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)、美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、葡萄酒有孢漢生酵母(Hanseniaspora vineae)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大隱球酵母(Cryptococcus magnus)、東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)。

本研究結(jié)果為寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)酵母菌分離篩選奠定基礎(chǔ),有關(guān)該產(chǎn)區(qū)酵母菌的發(fā)酵特性及其進(jìn)一步利用仍需繼續(xù)研究。

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