菌株CICC 6287發酵特性研究及其在辣椒發酵中的應用

謝九艷 翟磊 宋振 楊玉新 程池 姚粟

（1. 中國食品發酵工業研究院，北京 100027；2. 新疆中亞食品研發中心（有限公司），烏魯木齊 830001）

發酵辣椒（又稱剁辣椒）是我國的傳統食物，主要利用乳酸菌的自然發酵和高濃度食鹽的保存作用進行加工。工業發酵辣椒常在辣椒中加入約20%食鹽進行鹽醅發酵來保持辣椒的色澤、辣味和抑制發酵過程中雜菌的生長，但是也造成了亞硝酸鹽含量過高［1］，抑制乳酸菌等益生菌生長［2］等副作用。目前發酵辣椒經常通過調節食鹽的用量，控制發酵時間，調節初始pH值，使用純種乳酸菌發酵等方法來改善發酵辣椒的質量［3］。其中選育優質乳酸菌對辣椒發酵有著十分重要的作用，王雪雅等［4］通過純種發酵研究表明，發酵乳桿菌和食果糖乳桿菌是辣椒發酵過程中綜合品質較好的發酵優良菌株。鄧放明等［5］發現Lact.chili6和Lact.chili8在低鹽發酵過程中有著良好的優勢。發酵乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌等應用于辣椒發酵的研究較多［1］。所以研究具有良好特性的乳酸菌及其在果蔬發酵中的應用十分的必要。

產馬乳酒乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）屬于厚壁菌門（Firmicutes），芽胞桿菌綱（Bacilli），乳桿菌目（Lactococcus），乳桿菌科（Lactobacillaceae），乳桿菌屬（Lactobacillus），是一類革蘭氏陽性、兼性厭氧、同型發酵的桿狀乳酸菌，最初分離于開菲爾粒中，是開菲爾粒中的主要微生物［6］。目前含有Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens和Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum兩個亞種［7］。

產馬乳酒乳桿菌作為益生菌具有治療疾病、調節體內免疫水平的功能。具有抗結腸炎的功能、調節腸道功能紊亂［8］、有效的抑制EHEC感染［9］、緩解哮喘癥狀等功能［10］。產馬乳酒乳桿菌具有非常好的益生素活性，能夠很好的吸附在腸道快速繁殖，產生益菌素，調節腸道微生物的菌群，是未來功能食品的重要選擇［11］。但是目前產馬乳酒乳桿菌主要應用于乳制品發酵，國內外關于產馬乳酒乳桿菌做為果蔬發酵菌株研究的報道較少。本研究主要對CICC 6287進行鑒定和生物學特性研究，并將該菌株用于新疆特色辣椒發酵，評估 CICC 6287的發酵生物學特性對辣椒發酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株與培養條件 菌株CICC 6287分離于新疆特色乳制品樣品，保藏于中國工業微生物菌種保藏管理中心。菌株CICC 6287在MRS培養基37℃培養48 h。

用于抑菌試驗的菌種大腸桿菌（Escherichia coli）O157：H7 CICC 10907，腸沙門氏菌（Salmonella enteric）CICC 10871，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CICC 10790 和 單 增 李 斯 特 菌（Listeria monocytogenes）CICC 21635 均來自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 實驗試劑及設備 MRS培養基、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、革蘭氏染色試劑盒均購自北京陸橋技術有限公司；API試劑條購于生物梅里埃公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購于OMEGA公司；GoldView購自北京賽百盛基因技術有限公司；溶菌酶購自Sigma公司；蛋白酶購自Merk公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 marker購自北京天根生物有限公司。

pH計FE20購于梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；紫外分光光度計7200購于尤尼科（上海）儀器有限公司；溫度梯度PCR儀購于Biometra公司；恒溫培養箱BHG-8082型購于上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株CICC 6287多相分類學鑒定 利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株CICC 6287基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。以基因組DNA為模板，利用通用引物27F和1492R對該菌株的16S rRNA基因進行PCR擴增。PCR擴增反應體系按照PCR Mixture使用說明進行配制（Tiangen公司）。反應程序為：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，55℃復性 30 s，72℃延伸 1 min 30 s，30 個循環后72℃延伸10 min。擴增產物用0.8%的瓊脂糖進行檢測后，送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。使用ContigExpress軟件對測序結果進行分析，將分析后結果遞交到EzBioCloud和NCBI數據庫進行比對分析，確定菌株CICC 6287與已知菌株的同源關系。采用MEGA 4軟件中的Clustal 功能對菌株CICC 6287與近緣種菌株的16S rRNA基因和pheS基因進行多序列比對，并使用Neighbour-Joining法進行系統發育及分子進化分析［12］。

菌株CICC 6287接種到MRS培養基上，37℃培養48 h后，觀察菌落形態特征。收集新鮮菌體，加入2.5%戊二醛4℃固定過夜。離心收集菌體，100 mmoL/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）漂洗3次。50%，70%，85%，95%乙醇梯度脫水后100%乙醇脫水3次。脫水后使用儀器BAL-TEC CPD030進行二氧化碳臨界點干燥。噴金-離子濺射儀 BAL-TEC SCD005進行噴金后，使用掃描電鏡Hitachi SU8010進行菌體形態觀察。使用API 50 CH 鑒定系統對菌株CICC 6287底物利用特征進行測定［13］。

1.2.2 菌種CICC 6287生物學特性研究 挑取新鮮培養的單菌落接種到4 mL MRS液體培養基中，37℃靜置培養18 h后作為接種種子液。

生長及產酸能力測定：將種子液按1%接種量接種于200 mL MRS液體培養基中培養，以不接種培養基作為對照，每隔2 h取樣測定測定600 nm下吸光值（OD600），同時測定發酵液的pH值［14］。

耐鹽耐酸特性測定：將種子液按1%接種量接入分別含2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L和10 g/L NaCl以及入pH 2、3、4、5、6和7的MRS液體培養基中，37℃靜置培養48 h，測定600 nm下吸光值（OD600），并記錄結果［15］。

亞硝酸鹽降解能力測定：將種子液按1%接種量接種于含125 μg/mL NaNO2的200 mL MRS液體培養基中37℃培養，每隔24 h定時取樣測定NaNO2含量。參考GB/T 5009.33-2003中的鹽酸萘乙二胺法進行測定，不接種的MRS培養基（含125 μg/mL NaNO2）作為空白對照［16］。

氨基酸脫羧酶試驗：挑取新鮮培養的單菌落于3 mL無菌生理鹽水中研磨，制備成0.5 McFarland懸液，分別滴入氨基酸脫羧酶試驗的安培瓶中，每瓶三滴，并加無菌液體石蠟覆蓋培養基表面，培養24 h后，觀察試驗管與對照管顏色變化，試驗管為紫色，對照管為黃色，結果為陽性；試驗管與對照管均為黃色，結果為陰性。

抑菌試驗：采用濾紙片法測定目標菌株的抑菌性能。挑取新鮮培養的指示菌株大腸桿菌 O157：H7（Escherichia coli，CICC 10907）， 腸 沙 門 氏 菌（Salmonella enteric，CICC 10871），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CICC 10790）和單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，CICC 21635），將菌懸液濃度調至0.5 麥氏濁度并均勻涂布在TSA培養基上，然后將濾紙片浸泡在200 μL培養48 h的菌株CICC 6287發酵液中，置于上述培養基中，37℃培養箱中培養 48 h，記錄結果［17］。

1.2.3 發酵辣椒特性測定 將新疆辣椒清洗干凈打漿破碎后，將種子液按1%接種量接種于破碎辣椒中，同時加入3%糖和3%鹽，以不接乳酸菌的自然發酵辣椒為對照組，30℃恒溫連續發酵7 d。每天取樣測定發酵辣椒的pH值。按照GB/T 12456-2008：《食品中總酸的測定》中酸堿滴定法測定發酵辣椒的總酸含量［18］。使用HPLC法測定有機酸的種類和含量。按照GB 5009.33-2010：《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》測定發酵辣椒的亞硝酸鹽含量［19］。按照GB/T 5009.208-2008：《食品中生物胺含量的測定》使用HPLC法對發酵7 d的辣椒中生物胺的種類和含量進行測定［20］。

2 結果

2.1 菌種CICC 6287的形態學特征

從新疆特色乳制品中分離得到一株細菌，在MRS瓊脂培養基上37℃培養48 h，菌落為乳白色，圓形，光滑，濕潤，不透明，邊緣不整齊。菌體呈桿狀，大小為（0.5-0.6）μm × （1.6-5.1）μm，單個或成對排列，革蘭氏陽性，表現為典型的乳桿菌菌落特征。電鏡照片見圖1，保藏于中國工業微生物菌種保藏中心，菌株編號為CICC 6287。

2.2 菌種CICC 6287作為發酵菌株的生物學特征

為了解菌種CICC 6287的生長特征和作為辣椒發酵菌株的生物學特性，測定CICC 6287的生長曲線和不同生長時間的產酸能力。從圖2-A中看出，菌株CICC 6287培養8 h開始進入對數期，培養36 h進入穩定期。在對數期產酸速度較快，培養28 h pH值就降到4。表明產酸速率和生長速率成正比。進入穩定期后兩者都相對保持穩定。可能是較低的pH 值抑制了CICC 6287的生長，使其較早的進入穩定期。通過測定菌株對酸和鹽的耐受性，結果表明，CICC 6287生長最適pH值為6。隨著pH值降低，菌株CICC 6287生長受到明顯的抑制（圖2-B）。菌株CICC 6287 對NaCl耐受范圍為0-80 g/L，隨著NaCl濃度的升高，乳酸菌的生長受到明顯的抑制，在含80 g/L NaCl培養基中最終生長的OD600能夠達到0.4（圖2-B）。

圖1 菌株CICC 6287掃描電鏡圖

圖2 菌株CICC 6294生長和產酸特性（A）及耐酸和耐鹽性（B）

亞硝酸鹽降解能力測定試驗結果（表1）表明，CICC 6287隨著培養時間的延長，菌株降解的亞硝酸鹽越多。培養24 h后，菌株CICC 6287的亞硝酸鹽降解率可達到94.8%；培養36 h后，可達到100%。通過測定氨基酸脫羧酶的活性研究CICC 6287試驗結果表明，CICC 6287四種脫羧酶活性為陰性，表明菌株CICC 6287對游離氨基酸的脫羧酶活性弱，能夠較少的產生生物胺，減少發酵食品中的生物胺危害。抑菌試驗結果（表2）表明，菌株CICC 6287對致病菌腸炎沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑、單增李斯特菌都有抑制作用。

表1 菌株CICC 6287的氨基酸脫羧酶活性

表2 菌株CICC 6287的抑菌試驗

2.3 菌株CICC 6287多相分類學鑒定

通過擴增菌株16S rRNA基因序列并經過序列比對，確定與Lactobacillus kefiranofaciens的兩個亞種Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens LMG 19149T和Lactobacillus kefiranofaciens subsp.kefirgranum DSM 10550T的同源性最高。與其他菌株的同源率都低于98.65%，因此將該細菌鑒定為定為產馬乳酒乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）（圖3），其16S rRNA 基因序列登錄號為KY694991。利用API 50 CH測定其對碳源的利用，CICC 6287可以利用D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖等產酸（表3）。

圖3 菌株CICC 6287 16S rRNA基因系統發育樹

表3 菌株CICC 6287的碳源發酵產酸試驗

2.4 發酵辣椒特性測定

將CICC 6287作為辣椒發酵的菌種，測定其對辣椒發酵過程的影響。辣椒發酵試驗結果（圖4）表明，隨著發酵時間的增加，發酵辣椒的pH值不斷下降，發酵7 d后，pH值不再明顯下降，接種CICC 6287的辣椒最終pH值為3.03。自然發酵辣椒的最終pH值在3.26，明顯低于自然發酵?？偹岷亢蚿H值測定結果相一致，自然發酵辣椒的總酸含量僅為20.9 g/kg，接種菌株CICC 6287的發酵辣椒最終的酸含量能夠達到25.4 g/kg。接種菌株CICC 6287的發酵辣椒高于自然發酵的乳酸含量（表4），表明CICC 6287在辣椒發酵過程中對于酸的含量有重要作用。

辣椒發酵過程中，亞硝酸鹽的含量呈現先增加后減少的趨勢，發酵第2天亞硝酸鹽的含量達到峰值，含量在5.7-6.5 mg/kg。最終入菌株CICC 6287的辣椒中亞硝酸的含量僅為1.06 mg/kg，遠低于自然發酵中亞硝酸鹽含量（2.63 mg/kg）。

生物胺測定結果表明，發酵辣椒中的生物胺主要為腐胺。腐胺是由鳥氨酸脫羧酶生成，接入菌株CICC 6287能夠顯著的降低發酵辣椒中腐胺的含量，腐胺的含量僅為5.62 μg/mL，遠低于自然發酵辣椒的19.36 μg/mL，這表明菌株CICC 6287的接入能很大程度的提高發酵辣椒的安全性。

圖4 發酵辣椒性能測定（A）：pH和總酸（B）亞硝酸鹽含量

表4 發酵辣椒指標測定

3 討論

CICC 6287作為發酵菌株，在辣椒發酵過程中有優于其它菌株的發酵特性。根據不同乳酸菌菌株發酵特性測定的報道，在菌株對食鹽耐受能力方面，CICC 6287遠遠高于瑞士乳桿菌、植物乳桿菌等菌株［2］。在產酸能力和發酵辣椒的總酸含量方面，其產酸性能優于戊糖乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種等菌種。在降解亞硝酸鹽方面，CICC 6287的降解亞硝酸鹽能力強于乳酸片球菌等菌種［4］。CICC 6287的發酵特性優于先前報道的菌株，是提高辣椒發酵綜合品質的優良菌種。在后期可應用于工業化辣椒生產，提高了辣椒發酵的品質和市場競爭力。

食用安全性是目前發酵食品關注的重要問題，其中亞硝酸鹽和生物胺是影響發酵果蔬安全性的重要指標。攝取過量的亞硝酸鹽會引起癌變、抵抗甲狀腺素和智障等危害。生物胺會導致腎上腺素和胃酸過量分泌、心跳加快、血糖含量增加或血壓升高等癥狀［21］。亞硝酸鹽和生物胺同時存在有可能生成亞硝酸銨，從而引發肝癌的可能性［22］。本研究結果表明，菌株CICC 6287具有較強的亞硝酸鹽降解能力，接種該菌株的辣椒在發酵過程中表現為發酵初期亞硝酸鹽含量升高，后期亞硝酸鹽含量迅速降低。因為亞硝酸鹽降解分為酶降解和酸降解兩部分，在發酵初期較高pH的情況下主要進行酶降解。在發酵后期，pH降低到一定程度的情況下酸降解占主要部分［23］。所以在發酵初期微生物的數量較少，亞硝酸含量初步升高，隨著后期乳桿菌生物量的增大，產酸能力的增強，亞硝酸含量降解速度變快。接種菌株CICC 6287的辣椒發酵生物胺含量顯著降低。生物胺含量的降低，一方面與氨基酸脫羧酶活性相關，菌株CICC 6287多種氨基酸脫羧酶活性呈陰性，產生生物胺的能力降低；另一方面與乳桿菌中的SufI蛋白相關，據報道該蛋白能夠降解生物胺［24］。對于菌株CICC 6287降解生物胺的機理在今后的工作中可以進一步研究。

此外，菌株CICC 6287的生長和產酸特性也是其作為果蔬發酵菌種的重要條件。研究表明，接種菌株CICC 6287的發酵辣椒產酸速率快，乳酸含量相對較高，這與菌株CICC 6287生物學特性一致，CICC 6287前期生長速度快，產酸速度快，發酵前期成為辣椒發酵過程中的優勢菌種，在發酵后期由于乳酸的積累抑制乳酸菌的生長，使發酵辣椒的pH保持在穩定的水平［25］，其中乳酸對發酵食品的風味具有重要作用［26］。在發酵辣椒生產過程中，可通過調節乳酸鈣的含量調控辣椒中乳酸的含量［27］。

4 結論

通過對新疆特色乳制品中的菌株進行分離篩選，得到一株發酵生物性能較好的菌株CICC 6287。經鑒定為產馬乳酒乳桿菌，該菌種具有生長速度快、產酸效率高、鹽耐受力強、降解亞硝酸鹽等良好的發酵生物學特性。把菌株應用到辣椒發酵過程中，提高了發酵辣椒的酸度，降低了發酵辣椒中的亞硝酸鹽、生物胺的含量。CICC 6287是未來果蔬發酵菌株的重要選擇。

［1］歐陽晶, 陶湘林, 李梓銘, 等. 高鹽辣椒發酵過程中主要成分及風味的變化［J］. 食品科學, 2014, 35（4）：174-178.

［2］ 劉嘉, 蔣芳芳, 范琳, 等. 辣椒素對辣椒發酵中乳酸菌的影響［J］. 食品科學 , 2012, 33（3）：190-193.

［3］ 楊海燕, 沙漠, 于蒙, 等. 乳酸菌純種發酵辣椒醬工藝研究［J］.中國食品工業, 2011（9）：55-57.

［4］王雪雅, 吳華麗, 丁筑紅, 等. 純種乳酸菌接種發酵辣椒綜合品質特性研究［J］. 中國釀造, 2016, 35（9）：119-124.

［5］鄧放明, 李羅明, 尹華, 等. 碎鮮辣椒發酵制品發酵用乳酸菌的選育與接種發酵試驗［J］. 食品科學, 2005, 26（3）：106-109.

［6］Whiteman WB. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Volume 3［M］. 2nd ed. New York：Springer, 2010.

［7］李學明. 氧對馬奶酒樣乳桿菌ZW3代謝以及生物化學特性的影響［D］. 天津：天津科技大學, 2014.

［8］Chen YP, Hsiao PJ, Hong WS, et al. Lactobacillus kefiranofaciens M1 isolated from milk kefir grains ameliorates experimental colitis in vitro and in vivo［J］. J Dairy Sci, 2012, 95（1）：63-74.

［9］Chen YP, Lee TY, Hong WS, et al. Effects of Lactobacillus kefiranofaciens M1 isolated from kefir grains on enterohemorrhagic Escherichia coli infection using mouse and intestinal cell models［J］. J Dairy Sci, 2013, 96（12）：7467-7477.

［10］ Hong WS, et al. Effect of heat-inactivated kefir-isolated Lactobacillus kefiranofaciens M1 on preventing an allergic airway response in mice［J］. J Agric Food Chem, 2011, 59（16）：9022-9031.

［11］ Xing Z, et al. In vitro and in vivo evaluation of the probiotic attributes of Lactobacillus kefiranofaciens XL10 isolated from Tibetan kefir grain［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2017, 101（6）：1-11.

［12］ Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）software version 4. 0［J］. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24（8）：1596-1599.

［13］Ozgun D, Vural HC. Identification of Lactobacillus strains isolated from faecal specimens of babies and human milk colostrum by API 50 CHL system［J］. Journal of Medical Genetics and Genomics,2011, 3（3）：46-49.

［14］胡書芳, 王雁萍, 洪愛俊, 等. 自然發酵酸菜中乳酸菌的分離鑒定及其生理特性研究［J］. 安徽農業科學, 2009, 37（15）：6896-6898.

［15］ Beganovic J, Kos B, Lebos PA, et al. Traditionally produced sauerkraut as source of autochthonous functional starter cultures［J］.Microbiol Res, 2014, 169（7-8）：623-632.

［16］高書鋒, 陳丁賀, 莫許. 亞硝酸鹽降解菌的分離鑒定及其降解特性［J］. 環境科學與技術, 2011, 34（S2）：37-41.

［17］于娜. 具有抑菌作用乳桿菌的篩選及其抑菌物質特性的研究［D］. 呼和浩特：內蒙古農業大學, 2011.

［18］龔玲娣, 徐清渠. GB/T 12456-2008 食品中總酸的測定［S］.北京：中國標準出版社, 2008.

［19］GB 5009. 33-2010 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定［S］. 北京：中國標準出版社, 2010.

［20］吳永寧, 趙云峰, 李志軍, 等. GB/T 5009. 208-2008 食品中生物胺含量的測定［S］. 北京：中國標準出版社, 2008.

［21］Argyri A, Zoumpopoulou G, Karatzas KA, et al. Selection of potential probiotic lactic acid bacteria from fermented olives by in vitro tests［J］. Food Microbiology, 2013, 33（2）：282-291.

［22］李超, 董明盛. 一種改進的產生物胺乳酸菌的檢測方法［J］.食品科學, 2005, 26（6）：193-196.

［23］李澤麗. 應用植物乳桿菌降解亞硝酸鹽的研究［D］. 上海：上海師范大學, 2015.

［24］佟婷婷. 四川泡菜細菌多樣性分析及降生物胺菌株篩選［D］.無錫：江南大學, 2015.

［25］閆征, 王昌祿, 顧曉波. pH值對乳酸菌生長和乳酸產量的影響［J］. 食品與發酵工業, 2003, 29（6）：35-38.

［26］陳俊亮, 田芬, 霍貴成, 等. 乳酸乳球菌對切達干酪成熟過程中質構和風味的影響［J］. 食品科學, 2013, 21：163-167.

［27］姜愛麗, 胡文忠, 陳晨, 等. 乳酸鈣處理對乳酸發酵型辣椒品質的影響［J］. 食品與發酵工業, 2014, 40（1）：80-84.