小分子化合物誘導細胞重編程研究進展

顧珊 趙高平 李喜和，

（1. 內蒙古大學蒙古高原動物遺傳資源研究中心，呼和浩特 010021；2. 內蒙古賽科星家畜種業與繁育生物技術研究院有限公司，呼和浩特 011517）

細胞重編程指細胞內的基因表達由一種類型轉變為另一種類型，通常包含兩層含義：一是分化的細胞重新恢復到多能性或全能性狀態；二是從一種分化的細胞轉變為另一種分化的細胞。細胞重編程可為臨床患者特異性細胞治療提供無限的細胞資源，研究人員可以通過細胞核移植、轉染特定轉錄因子、小分子化合物誘導等途徑進行細胞重編程。細胞核移植技術可以將供體細胞核重新編程，進入類似受精卵發育的過程，發育到囊胚甚至產生完整個體，因此，細胞核移植技術成為早期研究中獲得用于疾病治療干細胞的可能途徑，但因細胞核移植技術通常需要使用卵子，而存在倫理問題的爭議導致其研究進一步受阻。自2006年山中伸彌等［1］首次利用轉錄因子介導的方法從體細胞獲得誘導多能干 細 胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs） 以來，重編程技術被廣泛研究，并試圖用于再生醫學領域。在重編程技術的引領下，細胞轉分化研究興起。但早前研究的細胞重編程和轉分化均涉及逆轉錄因子的介導，從而增加了基因突變的風險。近些年，研究者們開始探索更安全的細胞類型轉換方式，但轉換效率極低［2-5］。另外，更多的研究者試圖使用小分子化合物誘導細胞類型轉換。小分子化合物具有可替代重編程因子的重編程作用。如在誘導神經干細胞（Neural stem cells，NSCs）到iPSCs過程中，組蛋白甲基轉移酶G9a抑制劑BIX01294可替代 Oct4（O）［6］，Kenpaullone可以替代 Klf4（K）［7］。另外，在iPSCs產生過程中，轉化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）抑制劑 616452可以替代Sox2（S）［8-10］。因小分子化合物具有易滲透到細胞中，非免疫原性，成本效益低，更容易控制濃度和作用時間等諸多優勢，其誘導細胞重編程技術成為近年來細胞重編程領域新的研究方向。文中對小分子化合物誘導的幾種不同細胞重編程類型做了綜述，旨在為今后這方面的研究提供借鑒。

1 小分子化合物誘導多能干細胞

近些年研究發現小分子化合物可以提高重編程效率［11-15］，一些小分子化合物甚至可以替代逆轉錄因子。研究者試圖進一步用小分子化合物替換外源轉錄因子，最終實現完全的化學重編程。Li等［16］使用Oct4/Sox2/Klf4三個慢病毒表達載體轉染Oct4啟動子驅動綠色熒光蛋白（Oct4 promoterdriven green fluorescent protein，OG）標記的鼠成纖維細胞（Mouse embryonicfibroblasts，MEFs），同時采用小分子化合物丙戊酸（Valproic acid，VPA）與CHIR99021（CHIR）處理細胞，發現重編程效率顯著提高。隨后使用Oct4和Klf4轉染OG-MEFs，同時在VPA和CHIR基礎上，添加TGF-β抑制劑616452組成VC6共同處理細胞發現，15 d 后獲得GFP陽性的iPSCs，而僅使用單基因Oct4轉染與VC6組合進行重編程的效率極低。進一步研究發現組蛋白H3第4位賴氨酸去甲基化酶抑制劑反苯環丙胺（Tranylcypromine）可顯著提高重編程效率，與VC6組合（VC6T）處理僅轉染Oct4的OG-MEFs，18 d 后獲得GFP陽性iPSCs，該效率相比Oct4與VC6組合顯著提高。單基因Oct4與VC6T組合獲得的iPSCs（Oct4-iPSCs）具有正常的核型和堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）活性，形態學上類似典型的iPSCs，將Oct4-iPSCs注入免疫缺陷小鼠皮下組織，4周后可形成具有三胚層的畸胎瘤，將Oct4-iPSCs注入8細胞囊胚并移植于代孕母鼠子宮中可生產嵌合鼠。這些結果表明，Oct4-iPSCs具有類似于胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ESCs）的特性。

研究發現福斯科林（Forskolin，FSK），2-甲基-5-羥基色胺和D4476等小分子化合物在沒有Oct4基因表達的情況下，結合Sox2、Klf4和c-Myc（M）3個逆轉錄因子，可使OG-MEFs重編程為iPSCs，因此可作為Oct4的化學“替代物”。隨后使用VC6T與3種Oct4化學替代物共同處理OG-MEFs，發現VC6T與FSK組合（VC6TF）處理細胞16 d后得到GFP陽性克隆，這些GFP陽性克隆表達E-鈣黏蛋白，間質向上皮細胞轉化標記，類似于逆轉錄因子介導的早期重編程。但這些GFP陽性克隆Oct4和Nanog的啟動子區維持超甲基化狀態，表明Oct4和Nanog在表觀遺傳上仍處于抑制狀態［17］。為了實現完全化學重編程，Hou等［17］進一步篩選其他小分子化合物時發現，VC6TF處理細胞16 d 后加入DZNep（VC6TFZ），可獲得更多GFP陽性克隆，這些陽性克隆形態緊湊，具有上皮樣特征，無明顯邊界，大多數多能性標記基因的表達水平升高但仍低于ESCs表達水平，表明GFP陽性克隆仍處于不完全重編程狀態。將這些GFP陽性克隆經VC6TFZ處理28 d后轉到糖原合酶激酶-3（Glycogen synthase kinase，GSK3）和絲裂原活化蛋白雙重抑制（Dual inhibition，2i）培養基后，GFP陽性克隆逐漸轉變為ESCs樣形態。這些ESCs樣克隆可擴增培養30多代并維持ESCs樣形態。最后研究者將這些適應 2i 培養體系，ESCs樣，GFP陽性克隆定義為化學誘導多能干細胞（Chemically induced pluripotent stem cells，CiPSCs）。 隨 后 篩 選其他小分子化合物發現，合成物視黃酸受體配體TTNPB可提高化學重編程效率達到40 倍，達到逆轉錄因子介導的重編程效率（0.2%）。進一步分析建系的CiPSC發現，其倍增時間（14.1 h-15.1 h）類似于ESCs（14.7 h），具有AP活性并表達多能性標記，其基因表達譜與ESCs和OSKM-iPSCs相似。CiPSCs中的Oct4和Nanog啟動子的DNA甲基化狀態和組蛋白修飾類似于ESCs。此外，CiPSCs在13代以內具有正常核型和基因組完整性。將CiPSCs注射到免疫缺陷老鼠皮下能形成分化出三胚層的畸胎瘤。將CiPSCs注射到8細胞胚胎或囊胚中能產生嵌合鼠。相比OSKM-iPSCs產生的嵌合體，由CiPSCs產生的嵌合小鼠更健康，存活長達6個月。這些結果表明CiPSCs是完全重編程為多能性干細胞（Pluripotent stem cells，PSCs）。最后經優化后發現4個基本的小分子化合物（C6FZ）任何一個缺失均會顯著降低GFP陽性克隆率甚至無法獲得CiPSCs。

2 小分子化合物誘導潛能擴展的多能干細胞

PSCs可衍生出兩種功能不同的多能性狀態，原始態（naive）和始發態（primed）［18］。相比始發態PSCs，原始態PSCs具有更高的發育潛力［19-20］。始發態PSCs具有發育成三胚層的能力，但其不能發育到胚外層組織，如滋養層系，而滋養層系有助于胚盤發育［21］。受精卵和卵裂球在著床前發育均具有全能性，它們可分化產生胚胎和胚胎外譜系［22］。Yang等［23］根據鼠基態多能性條件（PD 0325901，CHIR和人白血病抑制因子（Human leukemia inhibitor factor，hLIF），篩選出一些小分子化合物以支持原始態。首先篩選出一些小分子化合物來激活Oct4遠端 增 強 子（Oct4 distal enhancer，Oct4-DE），Oct4-DE在胚胎著床前驅動Oct4基因表達，作為始發態多能性的分子標記。另外篩選出小分子化合物抑制TGF-β信號通路，該信號通路對于始發態hPSCs的自我更新必不可少。最終發現兩種小分子化合物，吡啶茚胺馬來酸鹽（（S）-（+）-dimethindene maleate，DiM） 和 鹽 酸 米 諾 環 素（Minocycline Hydrochloride，MiH）支持圓頂狀hPSCs長期自我更新。經過優化篩選，研究者建立了由hLIF、CHIR、DiM和MiH（LCDM）4個小分子化合物組成的最優培養體系，該體系可以使始發態hPSCs轉化為具有原始態特性的圓頂狀hPSCs。LCDM培養體系還可以使hESCs和hiPSCs獲得原始態特性。LCDM-hPSCs的生長速度快于始發態hPSCs，并呈現出更高的單細胞克隆效率，表達多能性標記基因，具備分化出三胚層的能力，具有較高的OCT4-DE活性，雌性細胞系中缺乏組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化位點，表明LCDM-hPSCs具備部分原始態hPSCs的特征。使用LCDM-mESCs做嵌合體分析發現，來源于LCDM-mESCs的細胞除了可以整合進入Em組織之外，還能整合進入ExEm組織中，這表明LCDM-mESCs可能具有擴展的發育能力。

3 小分子化合物誘導細胞轉分化

鑒于經典的iPSCs誘導技術，研究者相繼利用譜系特異性轉錄因子將體細胞直接重編程為其他類型細胞，如神經元細胞、肝臟細胞和心肌細胞等［24-28］。緊接著，小分子化合物誘導體細胞轉分化為不同細胞類型開始被探索。Cao等［29］用a肌球蛋白重鏈啟動子驅動GFP（Alphamyosin heavy chain promoter-driven GFP，aMHC-GFP）標記人包皮成纖維細胞（Human foreskinfibroblast，HFF），使用一些誘導和促進細胞重編程為其他類型細胞的小分子化合物結合心臟發生相關小分子化合物，誘導心臟發生。首先篩選出89個促進重編程的小分子化合物，隨后將每種小分子化合物分別添加到含SB431542，CHIR，tranylcypromine和FSK的基礎培養體系中，該基礎培養體系在單基因Oct4表達情況下可允許HFF轉分化為心肌細胞（Cardiomyocyte cells，CMs），HFF在基礎培養體系中培養6 d 后，轉入心臟誘導培養基（Cardiac induction medium，CIM）中培養5 d，CIM中含心臟發生小分子化合物激活素A，骨形成蛋白4（Bone morphogeneticprotein 4，BMP4），血管內皮細胞生長因子和CHIR，可以提高心臟基因表達。隨后將細胞再轉入人CMs條件培養基中進一步成熟。經過測試發現，15個小分子化合物（15C）的組合能誘導得到aMHC-GFP陽性克隆，進一步優化條件發 現，CHIR、A83-01、BIX01294、AS8351、SC1、Y27632和OAC27個小分子化合物（7C）對于有效誘導CMs重編程是必不可少的。另外發現血小板源生長因子途徑的兩個抑制劑SU16F和JNJ10198409（JNJ），可加速HFF基因的下調，并且提高了CMs重編程效率。將兩種抑制劑添加到7C中組成9C，可有效地提高誘導CMs重編程效率。研究者將這種化學誘導的功能性CMs命名為（Chemically induced functional CMs，ciCMs），ciCMs表達心肌細胞標記心肌肌鈣蛋白和心鈉素，免疫熒光檢測發現呈現出有序的心肌小節，細胞內膜電位顯示ciCMs應對節律性鈣瞬變呈現出同步的動作電位，在心臟發生程序上均較類似于人多能干細胞分化得到的CMs。將ciCMs移植入免疫缺陷鼠心肌梗死的部位，兩周后鼠心肌梗死部位發生部分再肌化。這些結果表明ciCMs被高度重編程，且功能類似CMs。

Zhang等［30］使用成纖維細胞特異性蛋白1-Cre/ROSA26tdTomato系統從原代MEFs中排除神經組織細胞，經流式細胞儀分選獲得的MEFs稱為tdMEFs，作為誘導NSCs的材料。隨后篩選出一些小分子化合物誘導MEFs的神經相關基因表達。BMP I型受體ALK2/3的抑制劑LDN193189和TGF-b I型受體ALK4/5/7的抑制劑A83-01，是抑制中胚層和內胚層特化的兩種小分子化合物。GSK3抑制劑CHIR和堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblasts growth factor，bFGF）是支持神經發育的兩種小分子化合物。這四種小分子化合物組合為化學特定培養基（M4）作為神經誘導的基礎條件。Sox2和巢蛋白（Nestin）是NSCs的兩個典型標記基因，MEFs經M4培養基培養10 d 后，未檢測到Sox2+/Nestin+細胞。而在M4中添加Smo拮抗劑Hh-Ag 1.5和維甲酸組成M6后培養MEFs，10 d 后獲得Sox2+/Nestin+細胞。另外，甲基轉移酶抑制劑RG108，組蛋白去甲基化酶抑制劑tranylcypromine和自噬調節劑SMER28可進一步促進Sox2+/Nestin+細胞的產生，將這3個小分子化合物添加到M6中組成M9。M9可有效誘導成纖維細胞轉分化為Sox2+/Nestin+細胞，去除其中任何一種均影響重編程效率。進一步研究發現M9處理的細胞經過一個MET過程，第6天逐漸出現克隆，這些經過MET過程的克隆具有AP活性，6 d 后，Sox2基因大量表達，到第10天，NSCs相關基因包括Pax6、Sox2、Ascl1和Olig2表達。隨后將M9誘導得到的Sox2+/Nestin+細胞轉入含bFGF和表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）的常規NSCs培養基中。這些細胞呈現出指數增長模式，懸浮培養后可形成神經球，細胞周期分布類似于原代神經前體細胞（Primaryneural progenitor cells，pri-NPCs）和NSCs。研究者將這種由纖維細胞獲得、增殖速率快、呈Sox2+/Nestin+并可自我更新的細胞命名為化學誘導神經干細胞樣細胞（Chemical-induced neural stem cell-like cells，ciNSLCs）。ciNSLCs在無 bFGF 和 EGF的分化條件下可分化為Tuj1+神經元和GFAP+（glial fibrillary acidic protein）星形膠質細胞。

4 展望

小分子化合物誘導細胞類型轉換已在人和鼠體內實現，通過小分子化合物從體細胞誘導獲得更安全的iPSCs、ciCMs和ciNSLCs，這些誘導細胞為臨床患者特異性治療帶來了希望。但小分子誘導細胞類型轉換效率有得提高，這也是目前小分子化合物研究的熱點和難點。此外，細胞重編程的內在機制還需進一步明確，從而篩選出更加安全可靠、誘導效率更高的小分子化合物或其他物質，從而為疾病治療提供有效的細胞資源。同時，這一研究有望對揭示某些癌癥的誘因并針對性提出相應的治療方案提供理論依據。另外，誘導細胞重編程研究主要集中在人和鼠的物種上，對其他大型哺乳動物如家畜豬牛羊的研究較少，也是未來需要探究的領域。

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