連作對大豆根際土壤細菌菌群結構的影響

殷繼忠 李亮 接偉光 蔡柏巖，

（1. 黑龍江大學生命科學學院 黑龍江省普通高等學校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080；2. 黑龍江東方學院食品與環境工程學部，哈爾濱 150066）

大豆作為一種重要的油料作物，在國民經濟中一直占有重要地位。近年來，隨著人們需求碳量的增大，耕地面積緊張導致大豆連作現象日益嚴重。黑龍江省是我國非轉基因大豆主要產區，然而，大豆連作現象極為嚴重［1］。作物連作會造成土壤理化性質惡化、土傳病害加劇及自毒作用，進而減少作物產量，影響作物正常生產［2-3］。在農田中，連作條件下大多依靠施肥來提高作物產量，但會破壞土壤結構、養分失衡、自毒物質積累，加劇作物土傳病害的產生［4］。

細菌群落結構在土壤養分中一直扮演重要角色［5］。研究表明，連作會破壞土壤微生物群落結構，促進病原微生物生長，抑制有益微生物繁殖，進而造成作物減產［6-7］。相關研究證實，連作障礙可危害黃瓜，番茄和大豆等大多數作物的生長［8-10］。研究發現，土壤受土壤種類、種植模式和種植作物種類等眾多因素影響，與間作種植模式相比，連作會導致土壤酶活性、微生物群落數和土壤養分均有降低［11］。近年來，有關根際土壤微生物菌群結構的研究多采用DGGE技術，但該技術僅能分析有限的優勢微生物類群，存在高估物種豐度以及低估微生物群落大小和多樣性的可能，并具有較大的隨機性很難檢測出低豐度的土壤微生物類群［12-13］。隨著測序技術的發展，高通量測序已成為定量和鑒別微生物群落演替的更好的研究工具［14］。該技術能夠在整體微生物細菌群落水平下分析物種遺傳多樣性，并能較為客觀的反映樣本中低豐度的重要功能微生物［15］。該技術具有測序通量高、試驗過程簡化、速度快、準確率高等優點，試驗結果能夠更好地反應出群落結構的特點。

本研究選用大豆品種為黑農48，大田選取連作0年和連作2年土樣。利用Illumina高通量測序技術分析對比根際土壤中的細菌多樣性旨在探索連作大豆根際土壤細菌群落結構，旨為改善連作大豆土壤菌群結構、提高大豆生長奠定前期理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗在哈爾濱工業大學糖業研究所試驗站進行。試驗土壤主要理化指標：有機質26.13 g/kg，全N 1.69 g/kg，全P 5.5 g/kg，全K 24.6 g/kg，堿解N 136.2 mg/kg，速效P 13.40 mg/kg，速效K 205 mg/kg，pH7.0。

試驗材料由黑龍江省農業科學院提供。選用黑龍江省主栽大豆品種：黑農48（HN48，高蛋白品種，蛋白質含量平均45%，脂肪含量平均為20%）。

1.2 方法

1.2.1 大田試驗設計 試驗土壤分別選用：連作0年（未種植大豆土壤，即第一年種植大豆土壤，三個生物學重復分別標記為L0 1、L0 2和L0 3）和連作2年（種植過2年大豆，及第三年種植大豆土壤，三個生物學重復分別標記為L2 1、L2 2和L2 3）大田土壤。2016年5月17日播種，生育期正常澆水。

1.2.2 樣本采集 在大豆成熟期進行采樣，三點取樣法隨機取樣，取10-20 cm大豆根際土壤樣本，每個土樣隨機采取三點，去除土樣中的植物和動物殘體等雜質，分別混合后過40目篩子，一部分裝入土袋中保存于-80℃冰箱中；另一部分用于土樣的高通量測序。

1.2.3 Illumina高通量測序 土壤樣本用干冰送到上海美吉生物醫藥科技有限公司，進行Illumina高通量測序。細菌的16S rDNA擴增引物選用V3-V4區引物（338F-806R），每個土壤樣本3個生物學重復。

1.2.4 有效序列和優化序列數據統計 運用多個樣品平行測序的方法，所以各樣品中的序列均引入了一段標示其樣本來源信息的barcode標簽序列及前引物（forward primer）序列。本次分析根據barcode標簽序列和前引物序列篩選出有效序列后，將測序接頭與barcode序列去除，并對處理后的有效序列進行數據統計。為了得到更高質量及更精準的生物信息分析結果，應對有效序列進行去雜。丟棄長度短于150 bp、含有模糊堿基、引物堿基含2個以上錯配的序列，即得到優化序列，之后對優化序列進行數據統計。

1.2.5 OTU-based分析 對所有樣品進行OTU生成并對OTU進行生物信息統計分析。將優化序列選取長度大于350 bp的序列并截齊后與silva庫比對后對序列進行聚類。聚類分析使用的軟件為 mothur和chopseq。

1.2.6 細菌群落多樣性分析 細菌群落物種的豐富度和多樣性分別用Chao指數和Shannon指數及Simpson指數表示，測序深度指數用Coverage表示。

1.2.7 群落結構分析 將優化序列根據silva庫中的參考序列鑒定OTU種屬。在門的水平上做樣品群落分布柱狀圖，比較3個土樣中的菌落分布情況。

2 結果

2.1 測序數據分析

通過Illumina高通量測序并優化后，樣品共獲得225 998條序列，總堿基數為136 050 796 bp，平均堿基長度為99 228 256 bp，其中421-440 bp和441-460 bp的堿基分別占總序列的45.61%和53.70%，如表所示。

表1 樣本序列長度分布

對測序獲得的序列進行隨機抽樣，以抽樣得到的序列數與他們所代表的OTU數目構建稀釋性曲線，從圖1中可以看出，6個樣本的稀釋性曲線菌區域平坦，這表明試驗測序數據合理，更多的測序數據只會產生少量新的OTU。

圖1 稀釋曲線圖

2.2 土壤細菌群落結構分析

通過比較DNA序列的相似性，將大于97%的序列相似性歸為同一種可操作分類單元（opertinal taxonomic unit，OTU）。對不同連作年限的大豆根際土壤細菌16S rDNA多樣性指數進行分析，L0_1、L0_2、L0_3、L2_1、L2_2及 L2_3的 Shannon指 數分別為6.70、6.68、6.63、6.56、6.58及6.60，Chao指數分別為2 144、2 133、2 130、2 023、2 101和2 044（表2），可以看出連作后細菌的多樣性和豐富度均有所降低。表明不同連作年限的大豆根際土壤的細菌群落結構存在差異，細菌多樣性及豐富度均降低。

表2 不同連作年限的土壤樣本中細菌豐富度和多樣性指數

通過表3的獨立樣本檢驗發現方差方程的Levene檢驗P=0.294＞0.05證明具有方差齊性；則P=0.019＜0.05證明連作0年與連作2年間的香農指數存在差異顯著。

由圖2可知，全部供試土壤中共檢測到10個細菌門，其中L2年中相對豐度大于1%的有10個，L0年的有9個。80%以上的細菌序列屬于變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）。而牙單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、硝化螺菌門（Nitrospirae）、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）的相對豐度所占比例較低。

隨著連作年限的增加細菌的門水平也隨之產生變化，變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度連作0年較連作2年有所增加，相似的放線菌門（Actinobacteria）也出現了豐度增加現象。而相反的酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度在連作2年要低于連作0年。

同時從數據庫中鑒定出418個屬，從土壤樣本細菌屬的相對豐度中能發現年際變化。從圖3可以看出大豆連作0年最豐富的細菌屬是Subgroup_6_norank，Anaerolineaceae和RB41_norank，而連作2年的細菌優勢屬為Subgroup_6_norank，Acidimicrobiales，Gemmatimonadaceae，Nitrosomonadaceae 和 Anaerolineaceae。

表3 不同連作年限香農指數的顯著性分析

圖2 連作2年與連作0年門水平群落結構組成圖

圖3 連作2年與連作0年屬水平群落結構組成圖

由圖3可知，通過對比分析發現連作大豆2年土樣中的酸微菌目（Acidimicrobiales_uncultured）、硝化螺菌屬（Nitrospira）、鞘氨醇菌屬（Sphingomonas）和芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對豐度要高于連作0年土樣。

2.3 群落結構分析

在屬的水平上對樣品和樣品所含菌屬進行聚類，根據聚類后的各樣品中不同OTU數，對應所含序列的豐度作出Heatmap（圖4），顏色梯度的變化，能夠反映出在菌屬水平上各樣品細菌群落結構的差異性。菌屬的豐度會受到大豆連作條件的影響，其中菌屬的豐度受作物種植方式影響最大的是Acinobacteria、Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi和Verrucomicrobia。在連作與輪作土壤中所測得的細菌菌屬中豐度差異較大的有：Acidimicrobiales、Gemmationadaceae、Nitrosomonadaceae 和 Anareolinenceae等。

由圖5可見，可以將大豆根際土壤16S rDNA細菌的Heatmap圖劃分為3個Cluster。首先Cluster1主要包括亞硝化細菌科、酸微菌目、厭氧繩菌科。大豆種植方式的改變影響著大豆根際土壤中的細菌相對豐度。連作2年中的酸微菌目豐度增加高于連作0年。Cluster2主要包括紅色桿菌屬、假諾卡氏菌屬、噬纖維素菌科以及一些未知的菌，其中紅色桿菌屬與噬纖維菌科相對豐度有所減少，而假諾卡氏菌屬略有增加。Cluster3中主要包括牙單胞菌屬、鏈霉菌屬、慢生根瘤菌屬等。從圖4可見，芽單胞菌屬在連作2年種植后豐度降低，但是鏈霉菌屬、及慢生根瘤菌屬在連作種植后細菌豐度高于輪作種植。

從總體來看，連作2年與連作0年相比，細菌群落結構和豐度變化并不顯著。這說明連作種植模式雖然會降低根際土壤中細菌多樣性但對細菌的群落結構和豐度影響較小。

3 討論

從影響部位看，連作造成的微生物群落變化主要發生在根際部位。雖然可培養微生物占土壤微生物總量的比例不足1%，但土壤中可培養細菌是對土壤生態系統貢獻最大的類群，它們比整個微生物群體更容易遭受土壤生態系統變化的影響，可用作與污染影響有關的指示劑［16-17］。土壤微生物幾乎參與土壤中一切生物和生物化學反應，其主要生理類群則直接參與土壤中C、N等營養元素的循環和能量流動，其數量和活性直接關系到土壤生態系統的維持和改善［18］。由此連作根際土壤中菌群結構變化一直是人們研究過程中的重點。

圖4 基于16S rDNA序列構建的熱圖

本實驗應用高通量測序技術得到的各處理Coverage指數均達到80%以上，證實本次測序結果可以反應樣本的真實情況。對于分析根際土壤中的不同微生物群落結構是十分有效的方法，多樣性指數數值越高則代表樣本中的微生物群落結構多樣性越高，它由群落的多樣性及群落的豐富度兩部分構成［19-20］。本研究結果表明，連作2年較連作0年土壤細菌的群落結構有明顯差異，Shannon指數和豐富度指數均呈現L0＞L2。可見隨著連作種植模式的出現，大豆根際土壤中的細菌多樣性隨之減少。大量研究證實連作會破壞土壤細菌菌群結構，降低土壤細菌多樣性及菌種的豐富度［3，21］。

本實驗研究中，連作年限不同的根際土壤中細菌群落結構存在一定的差異。連作0年土樣中的細

菌Shannon指數要高于連作2年土樣且差異顯著，這一結論表明連作后的土壤多樣性指數有所下降。同時通過試驗結果得知放線菌門（Actinobacteria）在連作2年與連作0年中表現出增加趨勢。連作種植后土樣中的放線菌數量增加，這一結果與孫秀山等［22］的研究結果相似。揭示長期連作會對細菌，真菌和放線菌造成的影響較大，而連作障礙在短時期內對細菌與放線菌造成的影響較?。?2］。大蒜在連作種植后，土壤中的細菌與放線菌數量均隨種植年限的增加而表現出先上升后下降態勢，在連作種植某年為期，在此之前細菌和放線菌的數量及微生物總量逐漸增多，之后猛然下降［23］。另外一些研究結果也有顯示，連作并沒有使土壤由細菌型向真菌型轉變。例如對地黃、太子參的相關研究證實，隨著連作年限的增加，土壤細菌數量下降極為顯著，但放線菌數量卻增加極為顯著［24-25］。

圖5 基于16S rDNA序列構建的熱圖

通過Heatmap圖和群落結構圖得知，大豆連作種植后根際土樣中的酸微菌目、根瘤菌屬、芽孢桿菌屬及鞘氨醇菌屬的相對豐度均大于輪作土樣，而纖維分解菌屬在連作土樣中相對豐度下降。且得出的試驗結果在其他作物種植過程中也有出現，如固氮菌與纖維素分解菌都作為有益微生物分別參與了土壤的氮素與碳素循環過程。李瓊芳［26］研究證實隨連作年限的增加，土壤中有益細菌數量銳減；當大蒜連作5-10年后，土壤中的硝化細菌和鞘氨醇單胞菌數量呈上升趨勢，并未有連作障礙的現象出現，只有經過連作15-20年后才會出現細菌數量的減少等明顯連作障礙現象［27］。李婧等［28］通過克隆文庫的研究方法證實，花生在連作后，土壤中的芽孢桿菌的群落結構發生改變，其中的一些芽孢桿菌如高地芽孢桿菌成為了土壤微生態環境的優勢菌群。同時在不同作物連作后，土壤細菌生理菌群的變化趨勢不盡相同：劉亞峰等［29］對黃瓜連作表明連作2 年土壤中自生固氮菌和纖維素分解菌數量均上升，第3年有所下降。而陳慧等［24］對地黃連作的研究表明連作地黃土壤中氨化細菌、反硝化細菌、好氣性固氮菌、嫌氣性纖維素分解菌、硫化細菌數量增多，好氣性纖維素分解菌大量減少。通過研究發現連作種植后，土壤中有益的芽孢桿菌、纖維素分解菌及固氮菌等有益細菌的數量增加，這與以上研究結果相一致。有益細菌未顯著減少表明細菌菌群結構變化并不顯著。

從Heatmap圖和群落結構圖的總體上看，細菌的多樣性和豐度變化不大，這也與大多數田間觀察結果相同。例如花生在連續種植期間根際細菌數量逐漸降低、真菌數量明顯上升［30］。通過對連作五年馬鈴薯的觀察發現其土壤中的尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌等數量增加，土傳病害愈加嚴重，進而影響作物生長。作物病蟲害更加嚴重。連作環境保持相對穩定的狀況會導致病蟲害的頻發。連作對細菌以及固氮菌均有抑制作用，而對真菌卻有著促進作用，土壤由細菌型轉換為真菌型，由高肥力轉變為低肥力［31，32］，連作后土壤中原有的優勢屬的線蟲群落如食細菌線蟲和食真菌線蟲顯著降低，而以植物寄生線蟲為優勢屬的線蟲開始破壞寄主植物，致使土壤不利于作物生長，進而造成減產［33］。由此可見致使作物連作的主要影響因素是真菌病害及線蟲病害，而細菌數量會逐漸降低，真菌病害逐年嚴重，這也與Heatmap圖細菌豐度變化較小的趨勢吻合。由此推測，連作土壤中細菌并不能夠占據主導地位，對連作的影響并不明顯，相較真菌的優勢性來看，細菌在土壤中發揮的作用較小。本研究結果表明大豆連作2年較連作0年硝化細菌和固氮菌數量均有減少的變化趨勢。由此推測在短期連作種植過程中，不同作物根際微生物類群的變化規律各不相同，難以用來推斷細菌在作物連作所存在普遍現象。

本研究應用高通量測序技術探究連作2年與連作0年土壤中的細菌群落結構變化。通過對兩種大豆種植模式根際土壤分析可知，連作0年土壤的多樣性指數高于連作2年土壤，這表明大豆的連作種植對土壤細菌群落結構有重要影響，但相對豐度較低且變化并不顯著，證明在連作土壤中細菌并不能占據主導地位發揮作用。因此，也有必要研究長期連作過程細菌群落結構的組成及多樣性隨著連作年限的延長發生的變化。

4 結論

研究結果與其他相關研究報道有相似之處，發現連作后土壤的有益細菌增加，如：鞘氨醇單胞菌、固氮菌、纖維素分解菌等。同時試驗發現連作2年土樣的微生物多樣性要低于連作0年，推測短期大豆連作雖然使細菌菌群多樣性降低，但是在大豆連作2年時并沒有產生嚴重的連作障礙現象，土壤中細菌菌群豐度也并未發生顯著變化。

［1］李亮, 魏麗娜, 崔佳琦, 蔡柏巖. 摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae對連作大豆分枝期根系AM真菌群落結構的影響［J］.菌物學報, 2016, 35（7）：882-891.

［2］Liu X, Zhang J, Gu T, et al. Microbial community diversities and taxa abundances in soils along a seven-year gradient of potato monoculture using high throughput pyrosequencing approach［J］.PLoS One, 2014, 9（1）：e86610.

［3］She S, Niu J, Zhang C, et al. Significant relationship between soil bacterial community structure and incidence of bacterial wilt disease under continuous cropping system［J］. Archives of Microbiology,2017（199）：267-275.

［4］Li X, Lewis EE, Liu Q, et al. Effects of long-term continuous cropping on soil nematode community and soil condition associated with replant problem in strawberry habitat［J］. Scientific Reports,2016, 6：30466.

［5］劉方春, 邢尚軍, 馬海林, 等. 持續干旱對櫻桃根際土壤細菌數量及結構多樣性影響［J］. 生態學報, 2014, 34（3）：642-649.

［6］Klein E, Katan J, Gamliel A. Soil suppressiveness to fusarium disease following organic amendments and solarization［J］. Plant Disease, 2011, 95（95）：1116-123.

［7］Dong L, Jiang X, Feng G, et al. Soil bacterial and fungal community dynamics in relation to Panax notoginseng death rate in a continuous cropping system［J］. Scientific Reports, 2016, 6：31802.

［8］Lu L, Yin S, Liu X, et al. Fungal networks in yield-invigorating and-debilitating soils induced by prolonged potato monoculture［J］.Soil Biology and Biochemistry, 2013, 65：186-194.

［9］Li B, Cui J, Jie W, Cai B. Analysis of the community compositions of rhizosphere fungi in soybeans continuous cropping fields［J］.Microbiol Res, 2015, 180：49-56.

［10］Zhang XP, Ning TY, Yang Y, et al. Effects of different application rates of calcium cyanamide on soil microbial biomass and enzyme activity in cucumber continuous cropping［J］. Chinese Journal of Applied Ecology, 2015, 26（10）： 3073-3082.

［11］Yang R, Mo Y, Liu C, et al. The effects of cattle manure and garlic rotation on soil under continuous cropping of watermelon（Citrullus lanatus L.）［J］. PLoS One, 2016, 11（6）：e0156515.

［12］Tan Y, Chen Q, Liu H J, et al. Bacteria community in different aged Coptis chinensis planting soil revealed by PCR-DGGE analysis［J］. China Journal of Chinese Materia Medica, 2015, 40（16）：3147.

［13］邢德峰, 任南琪. 應用DGGE研究微生物群落時的常見問題分析［J］. 微生物學報, 2006, 46（2）：331-5.

［14］Vo?í?ková J, Baldrian P. Fungal community on decomposing leaf litter undergoes rapid successional changes［J］. Isme Journal,2013, 7（3）：477-86.

［15］Cheng Y, Ma Q, Ren H, et al. Fine mapping of a Phytophthoraresistance gene RpsWY in soybean（Glycine max L.）by highthroughput genome-wide sequencing［J］. Theoretical & Applied Genetics, 2017, 130（5）：1041-1051.

［16］Ward DM, Weller R, Bbteson MM. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community［J］.Nature, 1990, 345（6270）：63-65.

［17］Ellis RJ, Morgan P, Weightman AJ, Fry JC. Cultivation-dependent and-independent approaches for determining bacterial diversity in heavy-metal-contaminated soil［J］. Applied & Environmental Microbiology, 2003, 69（6）：3223-3230.

［18］許光輝, 鄭洪元, 張德生, 等. 長白山北坡自然保護區森林土壤微生物生態分布及其生化特性的研究［J］. 生態學報,1984, 4（3）：9-25.

［19］Harcha BD, Corrella RL, Meechb W, et al. Using the Gini coefficient with BIOLOG substrate utilisation data to provide an alternative quantitative measure for comparing bacterial soil communities［J］. Journal of Microbiological Methods, 1997, 30（1）：91-101.

［20］張喜, 王莉莉, 劉延惠, 等. 喀斯特天然林植物多樣性指數和土壤理化指標的相關性［J］. 生態學報, 2016, 36（12）：3609-3620.

［21］Tan Y, Cui Y, Li H, et al. Diversity and composition of rhizospheric soil and root endogenous bacteria in Panax notoginseng during continuous cropping practices［J］. Journal of Basic Microbiology,2017, 57（4）.

［22］孫秀山, 封海勝, 萬書波, 左學青. 連作花生田主要微生物類群與土壤酶活性變化及其交互作用［J］. 作物學報, 2001, 27（5）：617-621.

［23］劉素慧, 劉世琦, 張自坤, 等. 大蒜連作對其根際土壤微生物和酶活性的影響［J］. 中國農業科學, 2010, 43（5）：1000-1006.

［24］陳慧, 郝慧榮, 熊君, 等. 地黃連作對根際微生物區系及土壤酶活性的影響［J］. 應用生態學報, 2007, 18（12）：2755-2759.

［25］林茂茲, 王海斌, 林輝鋒. 太子參連作對根際土壤微生物的影響［J］. 生態學雜志 , 2012, 31（1）：106-111.

［26］李瓊芳. 不同連作年限麥冬根際微生物區系動態研究［J］.土壤通報, 2006, 37（3）：563-565.

［27］周寶利, 徐妍, 尹玉玲, 葉雪凌. 不同連作年限土壤對茄子土壤生物學活性的影響及其嫁接調節［J］. 生態學雜志, 2010,29（2）：290-294.

［28］李婧, 陳廣波, 張坤, 崔中利, 曹慧. 花生連作紅壤芽孢桿菌的群落多樣性及其生防效果研究［J］. 土壤, 2012, 44（5）：776-781.

［29］劉亞鋒, 孫富林, 周毅, 賈新成. 黃瓜連作對土壤微生物區系的影響I——基于可培養微生物種群的數量分析［J］. 中國蔬菜, 2006, 1（7）：4-7.

［30］ Compant S, Duffy B, Nowak J, et al. Use of Plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases：principles, mechanisms of action, and future prospects［J］. Applied & Environmental Microbiology, 2005, 71（9）：4951-499.

［31］Yang R, Mo Y, Liu C, et al. The Effects of Cattle manure and garlic rotation on soil under continuous cropping of watermelon（Citrullus lanatus L.）：［J］. PLoS One, 2016, 11（6）：e0156515.

［32］ Xiong W, Zhao Q, Xue C, et al. Comparison of fungal community in black pepper-vanilla and vanilla monoculture systems associated with vanilla fusarium wilt disease［J］. Frontiers in Microbiology,2016, 7：117.

［33］馬媛媛, 李玉龍, 來航線, 等. 連作番茄根區病土對番茄生長及土壤線蟲與微生物的影響［J］. 中國生態農業學報, 2017,25（5）：730-739.