過表達miR-15b對斑馬魚血管發育的影響

栗曉亮楊 明黃 麗孫華欽許文明伍春蓮

（1.西華師范大學生命科學學院 西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川 南充 637009；2.四川大學華西第二醫院 四川大學-香港中文大學生殖醫學聯合實驗室教育部出生缺陷與相關婦兒疾病重點實驗室，四川 成都 610041）

0 引 言

MicroRNAs（miRNAs）是一類調控基因表達，自身不參與基因編碼的非編碼RNA分子，長度在22個堿基左右。雖然miRNA不參與編碼蛋白質，但是可通過結合目的mRNA的3'端非翻譯區（3'UTR），在轉錄后調節基因的表達[1-2]。前人研究顯示miRNA對細胞增殖、分化、凋亡，血管生成和腫瘤發生等現象具有重要作用[3-5]。此外，miRNA還可以調節早期的胚胎發育過程。斑馬魚做為動物研究的經典模式生物，具有通體透明，發育周期短，操作方便等優點；因此，研究miRNA在斑馬魚胚胎發育過程中的作用成為了關注熱點。

miR-15b屬于miR-15/107組群中的一員，核酸序列在不同的物種之間具有相對保守性。在人類的各種組織器官均可檢測到miR-15/107家族[6]的存在，沒有發現明顯的組織特異性（空間特異性），但是Bruchova[7]和Nelson[8]針對miR-15/107家族做表達譜的篩查時，發現在紅細胞生成和大腦發育過程中miR-15/107家族有發育階段特異性（時間特異性）。目前研究結果表明，miR-15b在B細胞惡性腫瘤、神經膠質瘤、肝癌、胃癌和肺腺癌等人類惡性腫瘤疾病中表達降低，并且可以作為治療癌癥預后判斷的分子靶標[9-12]。在膠質瘤中miR-15b可以靶向調節細胞周期蛋白（cyclin），從而調控細胞周期過程[13]；在肝癌和胃癌細胞中miR-15b與Bcl-2的基因表達呈負相關，即可以通過過表達miR-15b下調Bcl-2而誘發癌細胞的凋亡[14-16]。此外，還有研究證明，在人參皂苷促進血管形成過程中miR-15b通過靶向降解血管內皮細胞生長因子受體2（VEGFR2）的mRNA，抑制血管內皮細胞血管的形成[17]。目前尚無miR-15b在斑馬魚的早期胚胎發育和后期血管形成過程中的功能研究。

本研究利用轉基因斑馬魚（VEGFR2：GFP）為實驗對象，通過尼康體視顯微鏡進行表型觀察，可在體觀察血管的發育情況，運用全胚原位雜交（whole mountin situhybridization）、蛋白免疫印跡（western blot）、雙熒光素酶報告基因檢測（dual-fluorescence reporter system）等技術手段，研究探索miR-15b對斑馬魚血管發育的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗所用轉基因斑馬魚為血管綠色熒光標記斑馬魚（VEGFR2：GFP），飼養3個月后即可產卵。每天定時添加咸水豐年蟲充作飼料，照明14h黑暗10h交替，待其能夠產出健康魚卵后，將雌雄斑馬魚放入交配缸內，次日早上 8：00～10：00 時產卵后，將胚胎收集到含有小魚水的培養皿中，于28℃培養。

試驗用HEK293細胞及所用質粒為本實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 斑馬魚全胚原位雜交

將不同發育時期的斑馬魚胚胎剝去卵膜，收集到1.5mL RNA-Free的EP管中，每管加入10～50個斑馬魚胚胎，利用4%多聚甲醛（PFA）溶液固定過夜（至少12h）。梯度甲醇/PBST水合、蛋白酶K消化后，再使用4%PFA固定10min。棄掉固定液，用PBST洗滌3次，然后在預雜交液中，58℃預雜交3h。接著置于含 20～80 nmol/L 探針（購買自exiqon，Denmark，序列TGTAAACCATGTGCTGCTA）的雜交液中，58℃雜交過夜。于58℃使用2×SSC和0.2×SSC依次洗去未結合的探針，再于室溫下經梯度0.2×SSC/PBST溶液洗滌，以含山羊血清的PBST溶液室溫封閉探針3h；在稀釋5 000倍的抗地高辛抗體（anti-Dig-AP）中，4℃孵育過夜；之后用1×PBST溶液洗去未結合的抗體，然后加入顯色溶液（NBT+BCIP溶液）顯色1 h，用終止液快速洗去多余的顯色液，在尼康體視顯微鏡下觀察拍照并記錄。

1.2.2 細胞培養與質粒轉染

人胚腎細胞HEK-293培養于含有10%FBS的DMEM高糖培養基中，培養皿置于5%CO2、37℃的孵育箱內。

miR-15b mimic（miR10000784-1-5）購買自銳博生物。

1.2.3 蛋白免疫印跡實驗

從不同處理組的293細胞中提取總蛋白，使用BCA法對蛋白樣品進行定量檢測，使用5×SDS在99℃下煮10min變性處理，調整蛋白上樣量一致。用8%的SDS-PAGE凝膠60V恒壓30min，進入分離膠后90V恒壓90min后，將蛋白轉印到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜80 V恒壓2 h。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（anti-VEGFR2 1∶5000；anti-VEGFa 1∶5000；anti-βtubulin 1∶10 000）4℃孵育過夜，1×TBST 洗膜 3 次，二抗使用偶聯辣根過氧化物酶HRP的抗鼠或兔的抗體（1∶10 000）室溫孵育 1 h，TBST 洗 3 次，HRP 底物ECL發光液沖淋PVDF膜5min，曝光結果呈現于X光膠片。

1.2.4 雙熒光素酶活性檢測

1.2.5 數據分析

實驗數據使用GraphPad Prism 5軟件進行分析與作圖，圖表數據以平均值±標準差（Mean±SEM）呈現。*表示P＜0.05為顯著差異；**表示P＜0.01為極顯著差異；***表示P＜0.001。

2 結果與分析

2.1 miR-15b在斑馬魚胚胎發育過程中的時空特異性表達

本實驗首先運用斑馬魚全胚原位雜交檢測miR-15b在斑馬魚胚胎發育不同時期的時間和空間分布。檢測結果見圖1，藍色熒光區域表明miR-15b在胚胎發育早期高水平表達，隨著胚胎發育的進行，miR-15b表達水平逐步降低，到24 hpf（hours post-fertilization），檢測信號減弱。實驗結果顯示，miR-15b可能是母源性分子，推測其可能影響斑馬魚胚胎的發育。

2.2 過量表達miR-15b導致斑馬魚血管發生阻滯

本實驗利用血管綠色熒光標記斑馬魚（VEGFR2：GFP）模型，研究miR-15b在斑馬魚胚胎發育后期對血管形成能力的影響。將miR-15b MO注射到斑馬魚受精卵內，在胚胎發育早期過量表達miR-15b。實驗結果表明（見圖2），VEGFR2在斑馬魚整個血管系統內均有表達，在過量表達miR-15b處理組的斑馬魚中，VEGFR2在血管中的表達較弱于陰性對照miR-15b control處理組，并且實驗組斑馬魚表現出血管系統的發育畸形（58.4%）遠大于陰性對照組的斑馬魚畸形胚胎率18.7%（P＜0.05）。實驗結果中還揭示了在血管發育畸形的斑馬魚心臟周圍沒有出現血管簇。

2.3 miR-15b對VEGFR2表達的影響

由于過表達miR-15b會對斑馬魚血管系統有影響，因此在HEK-293細胞內研究miR-15b對VEGFR2的具體作用機制。分別將miR-15b mimic和miR-15b inhibitor轉染到HEK-293細胞體內，培養48 h后進行蛋白免疫印跡檢測。實驗結果表明（見圖 3（a），圖 3（b）），VEGFR2 基因表達水平與miR-15b基因表達水平呈負相關性，即抑制miR-15b的表達可以升高VEGFR2的表達水平，提高miR-15的表達則降低VEGFR2的表達水平。為了證明miR-15b可以靶向調控VEGFR2 mRNA水平，構建了含有VEGFR2 mRNA 3'UTR的pGL3-basic質粒，運用雙熒光素酶報告基因檢測技術，分別將miR-15b mimic，mimic control與 VEGFR2 mRNA 3'UTR 共同轉染HEK-293細胞48 h后進行檢測。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示（見圖3（c）），過量表達miR-15b后螢火蟲熒光值/海腎熒光值比對照組降低了57.2%，結果提示miR-15b可能通過靶向結合VEGFR2 mRNA 3'UTR來調控VEGFR2的表達。

圖1 miR-15b在斑馬魚早期胚胎發育過程中的時空表達

圖2 斑馬魚胚胎過表達miR-15b影響斑馬魚血管發育

圖3 miR-15b結合VEGFR2 mRNA的3'UTR區調控VEGFR2的表達

3 結束語

miRNA對斑馬魚胚胎發育、細胞分化、細胞凋亡、血管生成以及腫瘤發生等功能具有重要作用。miR-15b通過影響不同基因mRNA的穩定性，從而在基因轉錄后改變相應基因的表達水平，最終決定斑馬魚胚胎發育的生命歷程。斑馬魚作為胚胎發育研究的經典模式生物，已經有miRNA在斑馬魚胚胎發育的表達譜研究[18]，但是關于miR-15b對斑馬魚早期胚胎的發育過程中的功能研究報道較為少見，因此本研究對miR-15b對斑馬魚胚胎早期胚胎發育的影響做了一定的基礎研究。

本研究利用斑馬魚全胚原位雜交技術發現miR-15b在斑馬魚胚胎早期表達水平最高并且廣泛存在，隨發育的進行，miR-15b的探針信號逐漸減弱。說明miR-15b是母源性分子并且不具有空間特異性，這與Finnerty[6]研究miR-15家族在人類組織中的分布一致。有報道miR-15b[16]調控細胞凋亡和血管生成，進而導致心血管疾病，由此推測miR-15b或許會影響斑馬魚早期胚胎血管生成過程中有關基因的功能。

本研究利用轉基因斑馬魚（VEGFR2：GFP）為模式動物，在體內研究了miR-15b對斑馬魚血管系統早期發育的影響。通過注射miR-15b的類似物導致斑馬魚胚胎血管發育畸形，證實miR-15b的表達異常可導致斑馬魚血管系統發育異常。體外細胞研究結果表明，miR-15b通過調節VEGF下游信號通路分子VEGFR2影響血管系統發育，提示miR-15b的正常表達是斑馬魚胚胎發育良好的重要保證之一。

斑馬魚胚胎的正常發育過程需要不同的基因間精細而又復雜的調控[19]，斑馬魚胚胎的發育包括胚胎三胚層的分化，器官的發育和體節的形成等，需要包括Bmp，Wnt和RA等信號通路參與調控。miR-15b通過調節VEGF下游信號通路分子VEGFR2影響血管系統發育，為miRNA影響血管發育的機制提供了新的參考。miR-15b是否還參與調控了其他信號通路需要進一步的深入研究。之后將繼續圍繞miR-15b尋找其他的靶基因進行實驗研究，逐漸揭露miR-15b在斑馬魚胚胎早期發育中的作用機制。

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