葡萄抗霜霉病機制研究進展

喬寶營, 孫雷明, 張 柯, 孫文英*, 黃海帆, 劉崇懷

(1. 河南農業職業學院, 中牟 451450; 2. 中國農業科學院鄭州果樹研究所, 鄭州 450009;3. 河南省農業科學院園藝研究所, 鄭州 450002)

葡萄霜霉病由葡萄霜霉病菌引起,遍及世界各葡萄產區,是危害葡萄的重要病害之一。葡萄霜霉病在中國的各葡萄產區均有分布,特別是在多雨潮濕地區,發病更為嚴重,甚至還會影響翌年病害的發生率[1],給葡萄生產造成嚴重的經濟損失。目前生產上主要通過使用化學殺菌劑防治霜霉病[2],這不僅會因農藥殘留而降低果品質量,而且還會污染環境,給人們的身體健康造成潛在威脅,所以近年來一些研究者從綠色環保的角度出發,在篩選抗病品種以及培育抗病新品種方面做了大量工作[3-7]。本文結合前人對葡萄抗霜霉病的研究成果主要從植物學特征、生理生化性狀、與病害遺傳關系以及有關抗霜霉病分子研究三方面分別進行了分析和探討,希望為葡萄霜霉病抗性的研究與霜霉病防治提供依據。

1 結構抗性

1.1 葉片氣孔結構與抗病性

王國英[8]對抗病性不同的葡萄葉片的氣孔進行了電鏡掃描和光學顯微鏡觀察,發現葉片氣孔的密度和結構與葡萄抗霜霉病存在著一定的關系,抗病葡萄葉片氣孔小、稀少,氣孔周圍有白色的堆積物,而感病類型的氣孔大、密集;徐紅霞等[9]、喬寶營等[10]認為葡萄品種感霜霉病程度與葉片氣孔大小和氣孔密度呈正相關,葉片氣孔密而大時感病,稀而小時抗病,可以利用葡萄葉表氣孔密度直接作為霜霉病抗病性鑒定指標之一;劉天明等[11]則認為,葡萄對霜霉病的抗性與氣孔開張度、氣孔密度無相關性。

1.2 葉片表皮結構、葉背茸毛與抗病性的關系

Boubals[12]認為有些葡萄品種葉片的下表皮多毛,有的下表皮有一蠟質層,這些結構使葉表面不易濕潤而使游動孢子不能侵入葉片表皮而發芽;徐紅霞等[9]認為葡萄葉背茸毛極密的品種抗霜霉病,因為濃密的茸毛阻擋了病原菌的侵入。

2 生理生化抗性

2.1 過敏性的抗病反應

葡萄對霜霉病的防御反應,最明顯的是葡萄具有過敏性壞死反應。過敏性壞死反應是指病菌侵染抗病品種后,被侵入的細胞很快會失去活力而死亡;而侵染感病品種后,被侵細胞卻可活很久。有研究表明:過敏性反應的基本特征是細胞內單寧類、酚類化合物和其氧化衍生物的累積,這些物質可能在病菌感染前就已經積累了足夠的數量阻止病菌侵入,但是在多數情況下它們是在感染后被誘導產生而積累起來的。王國英[8]的研究表明:瘤枝葡萄中的‘嵐-5株系’、‘河岸葡萄’、‘藍葡萄’,秋葡萄中的‘江秋-2’、復葉葡萄的‘留-8’和‘留-9’、華東葡萄的‘白-13-1’、‘白-35-1’、‘白-36-1’株系以及山葡萄都具有過敏性的抗病反應。Diez-navajas等[13]在研究中發現接種霜霉病病原菌數小時后,抗霜霉病葡萄品種在感染的氣孔周圍觀察到過敏反應,有時候會產生壞死病斑。

2.2 產生毒素的抗病反應

植物抗毒素是指在植物受到機械損傷或各種病原物侵染后,會產生具有一定量的有毒物質,當其累積到一定濃度時可以抑制病菌的發展,植物表現抗性。Abadzhyan[14]用感霜霉病品種與抗病品種做人工接種試驗,7 d后經測定發現,抗霜霉病品種產生的植物抗毒素和細胞間有毒物質的毒性比感病品種強,這種毒性使霜霉病菌游動孢子死亡,抑制其感染蔓延至整個葉片。

2.3 酶活性與抗病反應

酶活性與葡萄抗霜霉病有密切的關系,現在研究的酶類主要包括過氧化物酶(POD)[15]、過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶 (PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)[16]、幾丁質酶(chitinase)[17]、芪合酶(STS)[18]等。Dai等[15]分別觀察接種霜霉病菌的感病、中抗和高抗葡萄品種,發現中抗品種接種后5 d檢測到過氧化物酶的活性。史娟等[19]、房玉林等[20]的研究表明,過氧化物酶(POD)活性與葡萄對霜霉菌的抗性密切相關,不同抗病性品種葉片感染霜霉病菌后POD活性在升高的速度和幅度上有顯著的差異,與感病品種‘乍娜’、‘紅地球’相比,抗病品種‘赤霞珠’的POD活性升速快、變化幅度大,而且POD高活性持續的時間長。林玲等[21]對高抗霜霉菌的毛葡萄野生株系接種霜霉病菌后檢測其葉片內的POD活性,結果表明POD活性升高幅度明顯高于感病的歐美雜種‘醉人香’和‘H-Norris’。而Abadzhyan[14]則研究認為,在受病原菌侵染的局部組織,POD活性升高快,出現壞死斑,感病品種的葉片內POD活性高于抗病品種,并且差異達到極顯著水平。齊慧霞等[22]對不同抗性的釀酒品種進行接種鑒定,認為感病品種接種后POD活性呈遞增趨勢,而抗病品種則呈遞減趨勢。

呂秀蘭等[23]、Perepelitsa等[24]發現,在葡萄未感病時CAT活性與抗病性之間關系不密切,但接種發病后供試葡萄品種CAT活性與霜霉病病情指數呈極顯著負相關,認為CAT的活性可作為葡萄品種對霜霉病抗性的一種輔助評價指標。而林玲等[21]認為不論抗病還是感病品種,在接種霜霉病菌后葡萄葉片內CAT活性均呈下降趨勢。

葡萄葉片接種霜霉病菌后,抗病品種和感病品種PPO活性有顯著的差異,抗病品種在接種后PPO活性不僅升速快、而且幅度大。感病品種接種后的PPO活性則下降[14, 24]。而呂秀蘭等[23]的研究表明,PPO活性與葡萄霜霉病病情指數呈極顯著負相關。

齊慧霞等[25]研究認為SOD活性在酒葡萄品種間存在著很大的差異,不同品種接種霜霉病菌后的SOD活性均高于接種前,并隨著發病程度加重,其活性則呈上升趨勢。但接種霜霉病菌后4～12 d內,葉片SOD活性有的呈遞減趨勢,也有的呈遞增趨勢。進一步研究發現,在葡萄霜霉菌誘導下抗病品種‘SV6059’體內SOD酶活性6 d內基本恢復到正常狀態,其自我調節恢復能力顯著大于感病品種 ‘品麗珠’。呂秀蘭等[23]則認為,接種前和接種后2 d,供試葡萄品種SOD活性和霜霉病發病指數相關性不顯著。林玲等[21]研究了毛葡萄接種霜霉病菌后SOD活性的變化情況,發現供試的5個毛葡萄野生株系、1個毛葡萄與歐亞種雜交后代、兩個歐美雜種接種霜霉病菌后SOD活性呈現先上升后下降的趨勢。

近年來,苯丙烷代謝與植物抗病性的關系,也引起了人們的重視。Perepelitsa等[24]研究認為PAL活性與葡萄對霜霉菌的抗性呈正相關,隨著PAL活性的變化,綠原酸和木質素在抗病品種中積累的速度和量大于感病品種,可能由PAL控制的苯丙烷代謝也是葡萄對霜霉病的抗性機制之一,PAL活性可作為葡萄品種抗霜霉病的一種輔助評價指標。

2.4 氮代謝與抗霜霉病的關系

氮代謝也是抗霜霉病機制研究的一個重要內容。寄主受到病原菌侵染后能夠產生病程相關蛋白,這種蛋白可能與抗病基因表達有關。Margaryan[26]研究發現所有感病植株的葉片總氮和蛋白質含量下降。Antonyan等[27-28]認為,對感病品種,健康葉片內天冬氨酸和谷氨酸的含量較高,而被霜霉病菌侵染后這些氨基酸的含量下降,而對抗病品種,被霜霉病菌侵染后葉片內氨基酸的含量反而上升。進一步測定感病和抗病品種的葉片及新梢的蛋白質含量,發現兩種類型的蛋白質含量相似。齊慧霞等[25]也認為,隨著發病程度加重,葡萄葉片內可溶性蛋白質含量逐漸下降。但也有研究認為葡萄感染霜霉病程度與葉內游離氨基酸含量無顯著相關性[11]。因此,可以推測抗病品種和感病品種合成蛋白質的能力明顯不同,氮代謝呈現出復雜性變化。

2.5 葉綠素含量與葡萄霜霉病的關系

葡萄品種葉片內葉綠素含量與霜霉病感病程度呈極顯著正相關。感病品種葉片內葉綠素含量比抗病品種高,但在發生霜霉病后抗病品種能抑制葉綠素含量的下降,使葉綠素含量很快恢復到正常的狀態,即葉片葉綠素總質量分數降幅與葉片病情指數呈顯著正相關[29]。葡萄感霜霉病程度與葉綠素a和葉綠素b的總量有密切關系,葉綠素總量越大的品種則越抗病,反之則越感病[6]。但也有研究認為葉綠素a的含量影響品種抗病程度,且效果明顯,葉綠素b的含量與抗病性關系不大[30]。

2.6 可溶性糖含量與抗病性的關系

Margaryan[26]認為抗霜霉病葡萄品種葉片中蔗糖含量低,而感病品種葉片中其含量較高;齊慧霞等[22,25]卻認為抗病品種葉片內可溶性糖含量高于感病品種,在感染霜霉病后,可溶性糖含量呈下降趨勢;但也有研究認為,葡萄對霜霉病的抗性與品種葉內的還原糖、淀粉等含量無顯著相關,而外施高濃度蔗糖能顯著降低霜霉病菌的致病力[11,31]。

2.7 酚類物質與抗病性的關系

植物組織內的酚類物質為木質素的合成提供大量的前體物質,有利于提高組織的成熟度,增強其抗逆性[32]。Margaryan[26]和Abadzhyan[31]認為高抗霜霉病的葡萄品種,其多酚含量也高。有研究使用高濃度鄰苯二酚處理離體葉片,發現其對霜霉病菌有明顯的抑制作用,因此認為酚類物質可能是葡萄抗霜霉菌擴展的主要物質[11,30]。

2.8 其他礦質元素與抗病性的關系

葡萄葉片中磷鉀養分含量與抗霜霉病也具有一定的相關性,當葉片中磷含量達0.14%,鉀含量達2.1%時,葉片發病率比對照降低40%左右[33]。鈣鉀比例也會影響品種的抗性,鉀含量與品種的抗病性呈負相關,葡萄細胞液中Ca/K比是決定抗霜霉病的一個重要因素,Ca/K比隨抗病程度而增加[9]。喬寶營等[10]則認為葡萄葉片中氮含量、磷含量、鉀含量與霜霉病發病程度關系不顯著。

3 與其他葡萄病害的遺傳相關性

葡萄霜霉病與其他病害也有一定的抗性遺傳關系,劉會寧等研究認為歐亞種品種感霜霉病和黑痘病之間是負相關的關系,但相關性不顯著,而歐亞種品種(系)后代對霜霉病和白粉病的抗病性存在極顯著相關性[34-36]。另外,胼胝體積累被認為是抵抗霜霉病的反應物之一,H2O2也是一個重要的防御信號,Liu等[37]使用3種中國野生抗病葡萄 (華東葡萄‘Baihe-35-1’, 刺葡萄‘Langao-5’和復葉葡萄‘Liuba-8’)和歐亞種易感品種(‘Pinot noir’),進行了病理學上的研究,通過苯胺藍染色表明3種中國野生抗病葡萄上有胼胝體積累,‘Baihe-35-1’還具有特殊的熒光光譜,使用3,3-二氨基聯苯胺進行比色,在‘Langao-5’和‘Liuba-8上產生了H2O2,這些特征在易感霜霉病的歐亞種‘Pinot noir’上則不存在。

4 分子抗性

隨著分子生物學的發展,葡萄抗霜霉病機制的研究已經深入到分子水平。Kim[38]認為葡萄抗霜霉病是由單基因控制,并存在修飾基因;何寧等[39]認為山葡萄抗霜霉病是受一對具有顯隱性關系基因控制;李華等[40]、賀普超等[41]、宋潤剛等[42]則認為葡萄抗霜霉病為表現數量性狀遺傳特征的多基因控制,抗病類型中的品種或品系中存在抗病的微效多基因并表現為累加性效應;Luo等[43]用BSA、SCAR和RAPD方法研究了葡萄感霜霉病基因的分子標記,發現RAPD標記OPO10-800與葡萄感霜霉病主效基因緊密連鎖,將該DNA片段克隆并測序,并將OPO10-835RAPD標記轉化為SCAR標記SCO10-835;此外,還發現RAPD標記OPO06-1500與葡萄抗霜霉病主效基因RPV1緊密連鎖,并將此RAPD標記轉化為SCAR標記SCO06-1500,這兩個SCAR標記均可用于葡萄對霜霉病的抗病與感病性鑒定。Fischer等[44]和Welter等[45]在18號連鎖群上定位了一個抗霜霉病的主效基因,在4號連鎖群上定位了一個微效基因;Kortekamp等[46]通過差異顯示技術對抗病的河岸葡萄和感病的歐洲葡萄進行了研究,發現并分離到一個定位10號連鎖群的VRP-1 抗病基因。Marguerit等[47]利用歐洲種‘赤霞珠’與美洲河岸葡萄‘Gloire de Montpellier’的138株雜交個體在12號連鎖群定位了2個新的跟霜霉抗性相關的位點Rpv5和Rpv6;Moreira等[48]分別利用‘Moscato Bianco’和V.riparia174個雜交一代,‘VRH3082 1-42’和‘SK77 5/3’94個雜交后代構建了兩張葡萄染色體連鎖圖譜,抗霜霉病的QTLs主要定位在第一張圖譜的7、12連鎖群上和第二張圖譜的7、8、12連鎖群上。

在定位葡萄霜霉病抗性QTLs的同時,研究者們也試圖克隆得到抗霜霉病的相關基因。Wu[49]等用Solexa測序的方法得到一些可能與抗霜霉病相關的基因和通路,從感病樣品中獲得15 249個基因,對照中獲得14 549 個基因,感病樣品與對照的差異表達基因富集的通路涉及核糖體代謝、光合作用、氨基酸與糖代謝以及淀粉和蔗糖代謝,Rpv1、NPR1的同源基因和PR蛋白編碼基因與葡萄霜霉病抗病機制有關。Polesani等[50]采用cDNA-AFLP技術分析感病品種‘雷司令’霜霉病感染的葉片,得到804個轉錄本,這為闡明霜霉病侵染過程的分子機制及識別抑制病原菌的相關基因提供了幫助。王平等[51]獲得10個與已知抗病基因相似保守結構域的葡萄抗病基因同源片段(RGA),同時定量PCR分析出RGA1、RGA2、RGA5和RGA23在感染霜霉菌后顯著表達,推測可能與葡萄抗霜霉病有關,使得克隆出抗霜霉病基因成為可能。孔祥久等[52]獲得葡萄霜霉菌候選效應子RXLR5信號肽,推測可能從葡萄霜霉菌細胞內分泌到胞外的過程中起重要作用。

不同基因型的葡萄對霜霉病的抗性也不同,V.vinifera葡萄對霜霉病敏感,V.rupestris葡萄中抗,V.amurensis葡萄抗霜霉病,圓葉葡萄則對霜霉病完全免疫[53]。Figueiredo等[54]利用基因芯片技術,在121個轉錄本中,發現代表感病‘Regent’和抗病的 ‘Trincadera’的29個差異表達基因。

5 小結

霜霉病不僅嚴重影響了葡萄的生長還影響了產量和品質。現今關于葡萄霜霉病抗性的研究雖然取得了一定的進展,但是由于不同葡萄品種(類型)對霜霉病的抗性強弱與其自身的形態結構和生理生化特性有著緊密的聯系,所以研究者往往在對葡萄霜霉病抗性的研究方面存在不同的見解。葡萄對霜霉病的抗病性涉及諸多因素,各因素間關系復雜,雖然至今未能確定出葡萄抗霜霉病的決定性因子,但是通過對抗性品種的抗病機制、遺傳進程或抗病基因的研究,結合長期雜交育種或轉基因的方式,將抗霜霉病性狀與葡萄優良性狀相結合,培育抗病品種是解決霜霉病的最安全有效、最有前景的方法。