DDX46基因慢病毒載體的構建及其在人膀胱癌細胞中的表達

劉 熹 張 沖 黃鄧高 曹 卉 高元慧 張淑芳 彭大為

膀胱癌的發病率在我國泌尿系惡性腫瘤中占居首位，在世界居第9位，1998～2008年發病率逐年增加，年均增長率4.6%[1]。膀胱癌術后高復發性和耐藥性一直是一個難題，因此，探索膀胱癌發生、發展的分子機制，尋找可靠的生物標志物和有效的治療靶點尤為重要[2]。DDX46基因，即DEAD-box解螺旋酶46基因，位于染色體5q31.1上，其編碼的DDX46蛋白屬于DEAD-box解螺旋酶家族成員(DEAD-box helicases，DDX)，又名PRPF5或hPrp5。DDX46表達產物主要分布在核內，通過影響mRNA前體剪接調控基因表達[3]。此外，多項研究[4-5]表明，DDX46與細胞增殖、分化和器官發育密切相關，并可以調控多個腫瘤相關因子的表達。結直腸癌組織中DDX46蛋白表達高于癌旁組織，敲低DDX46基因后，結直腸癌細胞生長受到抑制[6]。本研究前期通過轉錄組測序和生物信息學分析發現，DDX46基因在膀胱癌組織中高特異性表達。為進一步探討DDX46基因與膀胱癌的關系，本研究擬構建DDX46基因低表達慢病毒載體，包裝并感染人膀胱癌5637細胞和T24細胞，為探討其在膀胱癌細胞中的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、菌種與質粒 5637細胞、T24細胞及293T細胞(中科院上海細胞所)，TOP10大腸桿菌感受態細胞(TIANGEN公司)，慢病毒質粒系統包括GV115載體，pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體(上海吉凱公司)。

1.1.2 主要試劑及儀器 限制性內切酶Age I、EcoRI和雙切酶緩沖液CutSmart Buffer(NEB公司，美國)，T4DNA連接酶(Fermentas公司，加拿大)，Taq Plus酶(Vazyme公司，美國)，質粒抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒(TIANGEN公司，北京)，PCR 引物(R&F)和dsDNA寡核苷酸(捷瑞公司，上海)，胰蛋白酶和酵母提取物(OXOID公司，美國)，胎牛血清(Ausbian公司，澳大利亞)，DMEM培養基(Corning公司，美國)，TRIzolRNA 提取試劑盒(普飛，上海)，逆轉錄M-MLV試劑盒(Promega公司，美國)，氨芐青霉素(ampicillin，Amp)(Genebase公司，上海)。多重實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司，美國)，RT-PCR測量儀(Agilent公司，美國)，凝膠成像儀和數顯式穩壓電泳儀(天能公司，上海)，Nanodrop 2 000分光光度計(Thermo Scientific公司，美國)，NextSeq 500測序儀(Lllumina公司，美國)，IX71熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)，CO2培養箱(Sanyo公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 細胞株培養 人胚腎細胞系293T及人膀胱癌細胞系5637和T24均在37℃、2.5% CO2飽和濕度、10%胎牛血清的DMEM培養基上進行培養，培養至細胞融合70%～80%后，用0.1%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 RT-PCR測人膀胱癌細胞株中DDX46 mRNA表達水平 總RNA的提?。菏占毎芏葹?0%時的5637和T24人膀胱癌細胞，2 000 r/min離心5 min，去上清，留下細胞沉淀物，按上海普飛公司TRIzolRNA提取試劑盒操作說明書提取總RNA，同時用Nanodrop 2000分光光度計測定所提取的RNA 的濃度及質量。然后，反轉錄獲得cDNA，根據Promega公司逆轉錄M-MLV試劑盒說明書進行操作。最后，RT-PCR測DDX46 mRNA的表達水平，根據Gen Bank得知，目標基因DDX46和內參基因甘油醛磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的基因編號分別為NM 014829和NM 002046，設計引物：DDX46上游引物為5’-AAAATGGCGAGAAGAGCAACG-3’，下游引物為5’-CATCATCGTCCTCTAAACTCCAC-3’，產物擴增長度為110 bp；GAPDH上游引物為5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物為5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’，產物擴增長度為121 bp。RT-PCR反應條件(20 μL體系)：95℃ 15 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環45 次；qPCR 結束后，制作熔解曲線，反應條件：95℃ 1 min；冷卻至 55℃，使 DNA 雙鏈充分結合；從 55～95℃，每增加 0.5℃，保持 4 s，同時讀取吸光值，采用2-ΔCt法分析數據。

1.2.3 設計DDX46 RNA干擾靶點并合成寡核苷酸雙鏈 以DDX46基因為模板，設計多個19～21nt RNA干擾靶點序列，經設計軟件評估測定后，確定靶點序列為5’-GATTGTGATTGAAGAAGAA-3’，根據已選靶點序列設計DDX46 shRNA序列，并在兩端添加合適的限制性內切酶酶切位點形成DNA寡核苷酸鏈，同時在正鏈3’端添加TTTTT終止信號，在反鏈5’端添加終止信號互補序列，使其完整。將合成的單鏈DNA 寡核苷酸鏈干粉溶解于退火緩沖液中(終濃度100 mol/L)，90℃水浴15 min，自然冷卻至室溫后，最后形成帶黏性末端的雙鏈，命名為shDDX46，正義鏈：5’-CCGGGTGATTGTGATTGAAGAAGAATTCAAGAGATTCTTCTTCAATCAC

AATCACTTTTTG-3’，反義鏈：5’-AATTCAAAAAGTGATTGTGATTGAAGAAGAATCTCTTGAATTCTTCTTCAA

TCACAATCAC-3’，其中CCGG為AgeI酶切位點，AATTC為EcoRI酶切位點，G為EcoRI酶切位點互補序列。對照組則選擇已成熟的普適型陰性序列5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’作為核心序列，該序列在Gen bank中進行比對顯示僅和Zebrafish的2個基因有連續 16個堿基的同源性，命名為shRNA。

1.2.4 DDX46RNA干擾慢病毒載體的構建與鑒定 50 μL體系下37℃反應1 h，AgeI和EcoRI雙酶切GV115載體使其線性化。通過T4DNA連接酶，將兩組雙鏈DNA與線性化載體GV115 質粒的20 μL體系在16℃條件下反應1～3 h。取10 μL連接產物轉入100 μL新鮮制備的 TOP10大腸桿菌感受態細胞中，冰浴30 min，42℃熱激90 s，冰浴2 min，然后加入500 μL無抗菌藥物的(luria-bertani，LB)液體，于37℃、2 000 r/min震蕩培養1 h，最后取150 μL菌液均勻涂抹在含有Amp(100 μg/mL)的LB固體培養基上，37℃培養箱過夜培養。挑取陽性菌落進行瓊脂糖凝膠電泳檢測及測序分析，選擇測序正確的質粒進行后續實驗。

1.2.5 重組慢病毒的包裝與檢測 轉染前24 h，將處于對數生長期且細胞密度為5×109/mL的293T細胞接種于直徑10 cm 細胞培養皿中，37℃、5% CO2培養箱內培養24 h，當細胞密度達70%～80%時，將實驗組慢病毒(GV115-shDDX46RNA+pHelper 1.0+pHelper 2.0)和對照組慢病毒(GV115-shRNA+pHelper 1.0+pHelper 2.0)及相應體積的轉染試劑分別轉染293T細胞，培養6 h后，棄廢液清洗，加入含10%血清的細胞培養基20 mL，于 37℃、5% CO2培養箱內繼續培養48 h。收集細胞上清液，4℃、3 800 r/min離心10 min，除去細胞碎片，0.45 μm濾器過濾，濃縮、純化后進行病毒質量檢測，包括物理狀態檢測、無菌檢測及病毒滴度檢測，其中病毒滴度檢測具體方法為熒光梯度測定：測定前1 d，以每孔4×104/mL的密度將293T 細胞接種于96孔板，每孔100 μL，于37℃、5% CO2下培養24 h后進行病毒滴度測定，根據病毒的預期滴度，取7～10個Ep管，在每個管中加入90 μL無血清培養基，取待測定的病毒原液10 μL加入到第1管中，混勻后取10 μL加入到第2管中，依次倍比稀釋至最后1管；選取所需細胞孔，吸出90 μL培養基，加入90 μL 對應稀釋好的病毒溶液，繼續培養，24 h后加入完全培養基100 μL，3 d后觀察熒光表達情況。根據表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的293T 細胞數目計算實驗組和對照組的病毒滴度。

1.2.6 重組慢病毒感染膀胱癌細胞 將胰酶消化后處于對數生長期的人膀胱癌5 637細胞及T24細胞分別接種于6孔板內，待每孔細胞密度為2×105/個/ mL時，將實驗組重組慢病毒shDDX46和對照組重組慢病毒shRNA分別感染這2株人膀胱癌細胞。按慢病毒復染指數(MOI值)10進行轉染，實驗組病毒用量為6.67 μL，病毒滴度為3×108TU/mL，而對照組病毒用量為4.00 μL，病毒滴度為5×108TU/mL，常規培養液繼續培養。16 h后換液，72 h后熒光顯微鏡觀察細胞GFP表達。

1.2.7 RT-PCR檢測重組慢病毒感染膀胱癌細胞后DDX46 mRNA表達水平 取上述穩定感染后的兩株細胞系，分別進行總RNA的提取，反轉錄獲得 cDNA，RT-PCR檢測重組慢病毒感染膀胱癌細胞后DDX46 mRNA表達水平，觀察其受到抑制的情況，具體操作步驟同1.2.2。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測人膀胱癌細胞株中DDX46 mRNA的表達水平 5637細胞中DDX46 mRNA的表達水平(用ΔCt值表示)為(6.53±0.08)，T24細胞中DDX46 mRNA的表達水平(同上)為(8.48±0.11)。參照mRNA表達豐度標準：當ΔCt值≤12時，該細胞中基因表達豐度為高；當12<ΔCt值<16時，該細胞中基因表達豐度為中；當ΔCt值≥16時，該細胞中基因表達豐度為低。由此得知兩株膀胱癌細胞系均高豐度表達DDX46。

2.2 重組慢病毒陽性克隆瓊脂糖凝膠電泳結果 對照組shRNA陽性克隆PCR片段大小為307 bp，實驗組shDDX46陽性克隆PCR片段大小為345 bp，陽性菌落的PCR 克隆結果與兩組設計的基因大小基本一致，說明重組慢病毒構建成功，可進行后續測序。詳見圖1。

2.3 重組慢病毒PCR克隆后的測序結果 從上述實驗組陽性克隆中選取一組進行測序，測序結果與DDX46-shRNA序列一致，說明實驗組重組慢病毒shDDX46構建成功。詳見圖2。

2.4 重組慢病毒感染膀胱癌細胞 慢病毒感染72 h后，熒光顯微鏡下兩組細胞均表達GFP，但實驗組細胞GFP表達水平低于對照組細胞。詳見圖3、4。

圖1 DDX46干擾慢病毒載體陽性克隆瓊脂糖

注：1為陰性對照(雙蒸水)，排除系統中外源核酸污染導致假陽性結果；2為對照組(空載體自連對照組)；3為250 bp 標記物，從上至下依次為5 kb，3 kb，2 kb，1.5 kb，1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp；4～8均為實驗組

圖2 重組慢病毒shDDX46 PCR克隆后的測序結果

圖3 重組慢病毒感染5637細胞后GFP表達的鏡下結果

注：A為對照組shRNA GFP表達情況；B為實驗組shDDX46 GFP表達情況

圖4 重組慢病毒感染T24細胞后GFP表達的鏡下結果

注：A為對照組shRNA GFP表達情況；B為實驗組shDDX46GFP表達情況

2.5 RT-PCR檢測重組慢病毒感染膀胱癌細胞后DDX46 mRNA的表達水平 重組慢病毒感染膀胱癌細胞后，在5637細胞中，實驗組DDX46 mRNA的表達水平(用ΔCt值表示)為(0.32±0.01)，低于對照組(1.00±0.10)，差異有統計學意義(P=0.007)，其敲減效率為67.70%；在T24細胞中，實驗組DDX46 mRNA的表達水平(用ΔCt值表示)為(0.11±0.01)，低于對照組(1.00±0.03)，差異有統計學意義(P<0.001)，其敲減效率為89.00%。

3 討論

DEAD-box解螺旋酶家族因保守序列Ⅱ“DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)序列”而得名，除此之外，還含有其余8個相似序列(Q、I、Ia、Ib、III、IV、V、VI)，均具有高度保守的特性[7]。其編碼的相關蛋白廣泛存在于眾多生物中，均具有ATP酶活性、RNA結合活性、解旋活性及退火活性，在核糖體RNA的合成、前體RNA的剪接、RNA的穩定轉錄、運輸及降解等[8-9]中占有重要的地位。20世紀80年代晚期，DEAD-box解螺旋酶家族在Linder等[10]的酵母eIF4A 轉錄起始因子8個同系物研究中第一次被鑒定及定義。目前，人體中已檢測到43種DEAD-box 蛋白，各個蛋白中心解旋酶區域氨基酸序列雖然存在同源性，但其獨特的生物特性無法被取代[11]。DEAD-box解螺旋酶家族在植物等原核生物中研究較多，DEAD-box RNA 解旋酶基因RNA解旋酶22[12](RNA helicase 22，RH22)、RCF1[13]等相繼被發現。近年，隨著對腫瘤的深入研究，RNA憑借其在腫瘤發生發展中的重要作用成為研究熱點，DEAD-box解螺旋酶家族也逐漸被腫瘤研究學者重視，越來越多的DEAD-box蛋白被人熟知，但其功能機制仍不明了。DEAD-box解螺旋酶1(DEAD-box helicases 1，DDX1)蛋白最先在視網膜母細胞瘤細胞Y9 和RB522A 中被發現，且與MYCN基因共擴增并高表達，此后在大多數原發性腫瘤細胞系中也發現了其過表達現象，且其過表達可以使 NIH3T3細胞發生轉化產生致瘤性[14]。而Han等[15]在同系小鼠模型的研究中發現，抑制DDX1可促進卵巢腫瘤的生長和轉移，并有文獻[16]報道，DDX5可通過激活β-actin信號通路促進非小細胞肺癌的發生與發展；DDX5在急性淋巴瘤的發生中也占有重要地位，Lin等[17]發現，構建重組shRNA慢病毒載體敲低DEAD-box解螺旋酶5(DEAD-box helicases 1，DDX5)表達后，急性淋巴瘤細胞生長受到抑制，但容易凋亡，其靶標通路為Notch通路；DDX5在膀胱癌中也有研究，Chen等[18]發現，與膀胱癌癌旁正常組織比較，癌組織中DDX5高表達，但未深入研究。

DDX46在膀胱癌中未見報道，且其在人類腫瘤中的研究也極少。多位學者[19-21]研究發現，敲除卵巢癌細胞、食管鱗狀細胞癌和結腸癌細胞DDX46后，腫瘤細胞生長、生殖速度受到抑制，說明DDX46作為癌基因促進腫瘤的發生與發展。前期研究發現DDX46基因在膀胱癌組織中高特異表達，本研究利用慢病毒載體“轉移基因片段容量大、安全性較好、可感染非分裂細胞、可穩定整合于靶細胞的基因組”等特點[22]將重組慢病毒shDDX46成功轉入膀胱癌細胞5637、T24后有效抑制了DDX46mRNA的表達，且表達水平明顯低于對照組shRNA重組慢病毒轉染后的5637、T24細胞(P<0.05)，說明shDDX46已發揮其沉默DDX46的作用，為進一步研究外源性DDX46在膀胱癌增殖、分化、侵襲和轉移中的作用提供依據。

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