上調microRNA-34a抑制膠質瘤細胞的增殖及侵襲

段軍偉 唐曉平 張 濤 趙 龍 彭 華 段 劼

膠質瘤是成人常見的中樞神經系統腫瘤，起源于神經外胚層，包括少支膠質瘤、脈絡叢瘤、星形細胞瘤、神經元神經膠質混合瘤、胚胎性腫瘤等[1-2]，可引起顱內壓升高和腦組織受壓，臨床表現為頭痛、嘔吐、視力下降、記憶力減退等癥狀。目前，手術和放化療是治療膠質瘤的常用方法，但存在風險高、副作用大、復發率高、預后差等問題[3-4]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是近幾年發現的與腫瘤生長、增殖、侵襲以及凋亡相關的小分子RNA[5]。研究[6]表明，miRNA-34a在非小細胞肺癌、胰腺癌、結腸癌等多種惡性腫瘤中缺失或表達下調，說明miRNA-34a表達下調在腫瘤發生發展過程中起到一定作用。本研究旨在檢測膠質瘤組織中miRNA-34a表達情況，及對人腦膠質瘤細胞系U251細胞增殖、侵襲的影響，為膠質瘤基因治療提供可靠理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 采集川北醫學院附屬醫院2013年3月至2017年3月膠質瘤組織標本30例作為觀察組，采集重癥腦外傷需行手術者正常腦組織標本10例作為對照組。膠質瘤組織標本和正常腦組織標本采集均通知患者及其家屬，并自愿簽署知情同意書，本研究經本院倫理委員會批準。

1.2 細胞與試劑 人膠質瘤細胞系U251(上海江林細胞庫中心)，RPMI 1640培養液(美國，Gibco 公司)，10%新生牛血清(美國，Hyclon 公司)，TaqMan microRNA 逆轉錄試劑盒(上海慧穎生物科技有限公司)，Lipofectamine TM 2000(中國，北京盈豐大通科技有限公司)，四唑鹽比色法 (mosmann tetrazoliumtest，MTT) 試劑盒(美國，Sigma公司)，Transwell小室(美國，Invitrogen公司)。

1.3 熒光定量PCR檢測miRNA-34a的表達 根據一步法[7]miRNA說明書(北京，天根公司)中步驟提取膠質瘤組織和U251細胞系中總miRNA，然后根據逆轉錄試劑盒說明書步驟將其轉錄為cDNA，再進行real-time PCR反應，擴增條件為95℃ 10 min，95℃ 15 s，55℃ 1 min，共38個循環。內參基因為U6，采用2-ΔCt法計算基因相對表達量。

1.4 細胞轉染實驗 本研究分為3組，Control組(不轉染任何基因)、Mock組(轉染miRNA-neg序列)和miRNA-34a mimic組(轉染miRNA-34a mimic序列)。待U251細胞密度長至80%左右時，根據Lipofectamine TM 2000說明步驟將miRNA-neg(miRNA陰性對照序列)和miRNA-34a mimic(miRNA-34a模擬物)分別轉染進U251細胞中。miRNA-neg序列為 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’，miRNA-34a mimic序列為 5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’。

1.5 MTT實驗 將U251細胞接種于96孔板中，密度控制在5×104/mL左右，各組細胞在37℃、5% CO2培養箱中分別培養12、24、36、48、56、72 h。每孔加入10 μL MTT，繼續培養4 h，每孔加入100 μL 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，震蕩10 min，采用分光光度計檢測在570 nm處的光密度(D570)值，重復5次，取平均值。以上設置均為實驗孔，同時設置對照孔(未接種細胞，僅添加培養基，其他同實驗孔)。細胞增殖抑制率=實驗孔與空白孔D570值之差/空白孔D570值×100%。

1.6 Transwell實驗 U251細胞轉染48 h后進行細胞計數，將細胞密度控制在5×104/mL左右，采用24孔板Transwell小室，上室和下室分別加入200 μL細胞懸液和600 μL培養液，培養24 h，取出Transwell板，將上室中殘留細胞用脫脂棉簽擦去，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗3～4次，下室采用結晶紫染色20 min，PBS沖洗3～4次后，對膜下方細胞采用100倍顯微鏡下觀察并計數。每組重復3次。

2 結果

2.1 miRNA-34a的表達水平 miRNA-34a在人腦膠質瘤組織中相對表達水平為(0.35±0.07)，低于在人腦正常組織中相對表達水平(1.00±0.13)，差異有統計學意義(t=7.625，P=0.002)。

2.2 各組U251細胞系轉染后miRNA-34a相對表達量比較 轉染后，實時定量熒光PCR顯示，Control組、Mock組、miRNA-34a mimic組miRNA-34a相對表達水平分別為(1.00±0.08)、(0.98±0.11)和(6.19±0.34)，差異有統計學意義(F=604.928，P<0.001)，miRNA-34a mimic組與Control組、Mock組比較，差異有統計學意義(t=25.736、25.252，P<0.001)。

2.3 各組U251細胞增殖情況比較 MMT實驗結果顯示，在不同時間點，miRNA-34a mimic組U251細胞增殖抑制率高于Control和Mock組，差異有統計學意義(P均<0.05)。詳見表1。

表1 各組不同時間點U251細胞增殖情況比較

注：與Control組比較，*P<0.05；與Mock組比較，#P<0.05

2.4 上調miRNA-34a抑制U251細胞侵襲 Transwell實驗顯示，miRNA-34a mimic組U251細胞侵襲能力低于Control組和Mock組，差異有統計學意義(P<0.05)。Control組、Mock組和miRNA-34a mimic組侵襲細胞數分別為(90.53±5.84)個、(88.21±5.04)個和(27.46±2.76)個,差異有統計學意義(F=171.482，P=0.000)，miRNA-34a mimic組與Control組、Mock組比較，差異有統計學意義(t=16.912、18.311，P<0.001)。詳見圖1。

圖1 Transwell實驗檢測各組U251細胞侵襲能力

注：A為Control組，B為Mock組，C為miRNA-34a mimic組

3 討論

miRNA是一種含18～24個核苷酸的高度保守序列，可與靶基因3’非翻譯區靶位點特異性識別并結合，調控靶基因表達。研究[8-9]顯示，miRNA可調控超過90%的人類基因，可參與胚胎發育以及腫瘤發生過程。根據miRNA在腫瘤發生過程中作用不同，分為促癌miRNA和抑癌miRNA，miRNA-34a是研究相對較早的抑癌miRNA[10]。

miRNA-34a基因位于人源1號染色體短臂，可直接抑制CD44、Fra-1、Bcl-2、SIRT1、CDKs以及原癌蛋白表達，影響細胞增殖、遷移和侵襲，并加速細胞凋亡和壞死，從而達到抑癌目的[11]。張穎等[12]體外實驗發現，5637細胞系過表達miRNA-34a后，遷移力、侵襲力下降，增殖能力也受到抑制。莊彪等[13]發現，在轉染miRNA-34a的HCT116細胞中，miRNA-34a表達量增加7倍左右，細胞增殖能力下降約50%，細胞侵襲能力下降約60%，認為miRNA-34a抑制細胞增殖、侵襲與調控Bcl-2、MMP-2、MMP-9表達有關。

本研究發現，腦膠質瘤組織miRNA-34a表達量低于正常腦組織，提示下調miRNA-34a表達或miRNA-34a缺失可促進膠質瘤發生，與余肖等[14]研究結果一致。可能原因為：①P53基因發生突變；②人源1號染色體短臂發生缺失，20%～30%星形細胞瘤和70%～85%少突膠質細胞瘤被發現有1號染色體短臂等位基因缺失，而位于人源1號染色體短臂上的miRNA-34a編碼基因由于基因缺失，引起表達下調；③miRNA-34a編碼基因啟動子發生甲基化，部分惡性腫瘤發生與1號染色體短臂缺失有關，而在卵巢癌、肝癌中發現啟動子區CpG島甲基化可抑制miRNA-34a激活，從而引起miRNA-34a表達下調[15-16]。此外，本研究體外轉染實驗發現，miRNA-34a mimic轉染U251細胞后，miRNA-34a表達量上調，進而對轉染的U251細胞進行MMT實驗和Transwell實驗，發現miRNA-34a轉染組細胞增殖、侵襲能力均低于Control組和Mock組，提示上調miRNA-34a表達可抑制膠質瘤細胞增殖和侵襲。

綜上所述，上調miRNA-34a對膠質瘤細胞增殖和侵襲具有抑制作用，miRNA-34a可作為膠質瘤發生、發展、評估指標以及基因治療潛在靶點。

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