上調(diào)microRNA-34a抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖及侵襲

段軍偉 唐曉平 張 濤 趙 龍 彭 華 段 劼

膠質(zhì)瘤是成人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，起源于神經(jīng)外胚層，包括少支膠質(zhì)瘤、脈絡(luò)叢瘤、星形細胞瘤、神經(jīng)元神經(jīng)膠質(zhì)混合瘤、胚胎性腫瘤等[1-2]，可引起顱內(nèi)壓升高和腦組織受壓，臨床表現(xiàn)為頭痛、嘔吐、視力下降、記憶力減退等癥狀。目前，手術(shù)和放化療是治療膠質(zhì)瘤的常用方法，但存在風險高、副作用大、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差等問題[3-4]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是近幾年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤生長、增殖、侵襲以及凋亡相關(guān)的小分子RNA[5]。研究[6]表明，miRNA-34a在非小細胞肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中缺失或表達下調(diào)，說明miRNA-34a表達下調(diào)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到一定作用。本研究旨在檢測膠質(zhì)瘤組織中miRNA-34a表達情況，及對人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251細胞增殖、侵襲的影響，為膠質(zhì)瘤基因治療提供可靠理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 采集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2013年3月至2017年3月膠質(zhì)瘤組織標本30例作為觀察組，采集重癥腦外傷需行手術(shù)者正常腦組織標本10例作為對照組。膠質(zhì)瘤組織標本和正常腦組織標本采集均通知患者及其家屬，并自愿簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2 細胞與試劑 人膠質(zhì)瘤細胞系U251(上海江林細胞庫中心)，RPMI 1640培養(yǎng)液(美國，Gibco 公司)，10%新生牛血清(美國，Hyclon 公司)，TaqMan microRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海慧穎生物科技有限公司)，Lipofectamine TM 2000(中國，北京盈豐大通科技有限公司)，四唑鹽比色法 (mosmann tetrazoliumtest，MTT) 試劑盒(美國，Sigma公司)，Transwell小室(美國，Invitrogen公司)。

1.3 熒光定量PCR檢測miRNA-34a的表達 根據(jù)一步法[7]miRNA說明書(北京，天根公司)中步驟提取膠質(zhì)瘤組織和U251細胞系中總miRNA，然后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將其轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行real-time PCR反應(yīng)，擴增條件為95℃ 10 min，95℃ 15 s，55℃ 1 min，共38個循環(huán)。內(nèi)參基因為U6，采用2-ΔCt法計算基因相對表達量。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染實驗 本研究分為3組，Control組(不轉(zhuǎn)染任何基因)、Mock組(轉(zhuǎn)染miRNA-neg序列)和miRNA-34a mimic組(轉(zhuǎn)染miRNA-34a mimic序列)。待U251細胞密度長至80%左右時，根據(jù)Lipofectamine TM 2000說明步驟將miRNA-neg(miRNA陰性對照序列)和miRNA-34a mimic(miRNA-34a模擬物)分別轉(zhuǎn)染進U251細胞中。miRNA-neg序列為 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’，miRNA-34a mimic序列為 5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’。

1.5 MTT實驗 將U251細胞接種于96孔板中，密度控制在5×104/mL左右，各組細胞在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、36、48、56、72 h。每孔加入10 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，震蕩10 min，采用分光光度計檢測在570 nm處的光密度(D570)值，重復(fù)5次，取平均值。以上設(shè)置均為實驗孔，同時設(shè)置對照孔(未接種細胞，僅添加培養(yǎng)基，其他同實驗孔)。細胞增殖抑制率=實驗孔與空白孔D570值之差/空白孔D570值×100%。

1.6 Transwell實驗 U251細胞轉(zhuǎn)染48 h后進行細胞計數(shù)，將細胞密度控制在5×104/mL左右，采用24孔板Transwell小室，上室和下室分別加入200 μL細胞懸液和600 μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，取出Transwell板，將上室中殘留細胞用脫脂棉簽擦去，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗3～4次，下室采用結(jié)晶紫染色20 min，PBS沖洗3～4次后，對膜下方細胞采用100倍顯微鏡下觀察并計數(shù)。每組重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-34a的表達水平 miRNA-34a在人腦膠質(zhì)瘤組織中相對表達水平為(0.35±0.07)，低于在人腦正常組織中相對表達水平(1.00±0.13)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.625，P=0.002)。

2.2 各組U251細胞系轉(zhuǎn)染后miRNA-34a相對表達量比較 轉(zhuǎn)染后，實時定量熒光PCR顯示，Control組、Mock組、miRNA-34a mimic組miRNA-34a相對表達水平分別為(1.00±0.08)、(0.98±0.11)和(6.19±0.34)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=604.928，P<0.001)，miRNA-34a mimic組與Control組、Mock組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=25.736、25.252，P<0.001)。

2.3 各組U251細胞增殖情況比較 MMT實驗結(jié)果顯示，在不同時間點，miRNA-34a mimic組U251細胞增殖抑制率高于Control和Mock組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。詳見表1。

表1 各組不同時間點U251細胞增殖情況比較

注：與Control組比較，*P<0.05；與Mock組比較，#P<0.05

2.4 上調(diào)miRNA-34a抑制U251細胞侵襲 Transwell實驗顯示，miRNA-34a mimic組U251細胞侵襲能力低于Control組和Mock組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Control組、Mock組和miRNA-34a mimic組侵襲細胞數(shù)分別為(90.53±5.84)個、(88.21±5.04)個和(27.46±2.76)個,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=171.482，P=0.000)，miRNA-34a mimic組與Control組、Mock組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.912、18.311，P<0.001)。詳見圖1。

圖1 Transwell實驗檢測各組U251細胞侵襲能力

注：A為Control組，B為Mock組，C為miRNA-34a mimic組

3 討論

miRNA是一種含18～24個核苷酸的高度保守序列，可與靶基因3’非翻譯區(qū)靶位點特異性識別并結(jié)合，調(diào)控靶基因表達。研究[8-9]顯示，miRNA可調(diào)控超過90%的人類基因，可參與胚胎發(fā)育以及腫瘤發(fā)生過程。根據(jù)miRNA在腫瘤發(fā)生過程中作用不同，分為促癌miRNA和抑癌miRNA，miRNA-34a是研究相對較早的抑癌miRNA[10]。

miRNA-34a基因位于人源1號染色體短臂，可直接抑制CD44、Fra-1、Bcl-2、SIRT1、CDKs以及原癌蛋白表達，影響細胞增殖、遷移和侵襲，并加速細胞凋亡和壞死，從而達到抑癌目的[11]。張穎等[12]體外實驗發(fā)現(xiàn)，5637細胞系過表達miRNA-34a后，遷移力、侵襲力下降，增殖能力也受到抑制。莊彪等[13]發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染miRNA-34a的HCT116細胞中，miRNA-34a表達量增加7倍左右，細胞增殖能力下降約50%，細胞侵襲能力下降約60%，認為miRNA-34a抑制細胞增殖、侵襲與調(diào)控Bcl-2、MMP-2、MMP-9表達有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤組織miRNA-34a表達量低于正常腦組織，提示下調(diào)miRNA-34a表達或miRNA-34a缺失可促進膠質(zhì)瘤發(fā)生，與余肖等[14]研究結(jié)果一致。可能原因為：①P53基因發(fā)生突變；②人源1號染色體短臂發(fā)生缺失，20%～30%星形細胞瘤和70%～85%少突膠質(zhì)細胞瘤被發(fā)現(xiàn)有1號染色體短臂等位基因缺失，而位于人源1號染色體短臂上的miRNA-34a編碼基因由于基因缺失，引起表達下調(diào)；③miRNA-34a編碼基因啟動子發(fā)生甲基化，部分惡性腫瘤發(fā)生與1號染色體短臂缺失有關(guān)，而在卵巢癌、肝癌中發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)CpG島甲基化可抑制miRNA-34a激活，從而引起miRNA-34a表達下調(diào)[15-16]。此外，本研究體外轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a mimic轉(zhuǎn)染U251細胞后，miRNA-34a表達量上調(diào)，進而對轉(zhuǎn)染的U251細胞進行MMT實驗和Transwell實驗，發(fā)現(xiàn)miRNA-34a轉(zhuǎn)染組細胞增殖、侵襲能力均低于Control組和Mock組，提示上調(diào)miRNA-34a表達可抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲。

綜上所述，上調(diào)miRNA-34a對膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲具有抑制作用，miRNA-34a可作為膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展、評估指標以及基因治療潛在靶點。

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