荷芪散對多囊卵巢綜合征大鼠內分泌代謝及PI3K/AKT信號通路的影響

趙恒俠，周道成，李惠林，張世茂，劉 媛，鄭夏潔，陳 哲，張 卓

(1. 廣東省深圳市中醫院，廣東 深圳 518033；2. 廣州中醫藥大學第四臨床醫學院，廣東 深圳 518033)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是以多病因和臨床表現極不均一為主要特征的一種常見內分泌代謝綜合征，至今病因和發病機制仍不明確。其典型的臨床表現為不同程度的月經異常、不孕、多毛、痤瘡、肥胖、卵巢多囊性改變等，并常伴隨胰島素抵抗(IR)、高血脂癥和高胰島素血癥等[1]。有研究表明，PCOS卵巢局部IR與miRNA表達異常導致的PI3K/AKT信號通路傳導障礙緊密相關[2]。荷芪散是自擬經驗方，具有填精固腎、醒脾祛濕、行氣化痰等功效，用于治療多囊卵巢綜合征不僅可降糖調脂，還可調節性激素水平，改善卵巢形態。本研究旨在通過觀察荷芪散對PCOS大鼠模型糖脂代謝、性激素和卵巢形態以及PI3K/AKT信號通路基因表達量的影響，探討其可能的作用機制。

1 實驗資料

1.1動物及飼養 健康SPF級雌性SD大鼠60只，約21 d日齡，體質量(200±10)g，均由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，標準實驗環境下飼養，自由攝水、攝食。普通飲水及基礎飼料由廣州永諾生物科技有限公司提供。

1.2主要藥品 ①荷芪散復方制劑由深圳市中醫院制備，由荷葉30 g、黃芪30 g、決明子30 g、山藥15 g、桃仁10 g、石菖蒲10 g、制何首烏15 g、法半夏10 g、紅花10 g、當歸15 g、冬瓜皮15 g、仙茅15 g、淫羊藿15 g、菟絲子15 g、甘草5 g組成。生藥由深圳市中醫院中藥房提供，并由深圳市中醫院制劑室協助煎煮、過濾，濃縮成含生藥8.1 g/mL的溶液。②二甲雙胍(商品名：格華止，中美上海施貴寶制藥有限公司)，用溫熱蒸餾水融化，并濃縮成含生藥0.135 g/mL的溶液。③注射用脫氫表雄酮(DHEA)由湖北遠成藥業公司提供，注射用油由浙江田雨山藥公司提供。

1.3主要試劑 血糖、血脂試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；空腹胰島素(FINS)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、睪酮(T)放免試劑盒由北京北方生物技術研究所提供。RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒及PCR引物合成均由日本Takara公司提供。

1.4主要儀器及設備 旋渦振蕩器(海門市其林貝爾，vortex-5)，手提式高速分散器(寧波新芝，S10)，紫外可見分光光度計(上海奧譜勒儀器，UV-752P)，移液槍(Eppendorf)，電泳儀(Tanon，EPS300)，紫外透射分析儀(Hema,UV-3A)，電子天平(上海精密科學儀器，JA1003N)，實驗室pH計(METTLER TOLEDO)，數顯恒溫水浴鍋(江蘇環宇科學儀器，HH-4)，冷凍高速離心機(Hema,TGL-16R)，手掌離心機(新莊醫療器械，XK-400)，冰箱(Siemens & Haier)，基因擴增儀(Hema，Hema9600)，Real-time Quantitative PCR(ABI，StepOne Plus)。

1.5分組、造模及干預 所有大鼠標準飼料適應性喂養2周后，隨機選出15只大鼠作為正常組，每日頸背部皮下注射油劑0.2 mL/100 g，連續4周；剩下45只大鼠每日頸背部皮下注射DHEA溶液(DHEA溶于注射用油劑，濃度為30 mg/mL)0.2 mL/100 g進行造模，連續4周。全部大鼠每周稱體質量1次。第10周齡大鼠陰道開口，取陰道涂片連續觀察2個性周期(1個性周期為5 d)，觀察各組大鼠動情周期變化。全部大鼠于第12周齡稱體質量，眼眶后靜脈取血、離心、分離血清，采用放射免疫法檢測血清T、FINS。以陰道涂片連續出現角化細胞、失去完整動情周期、血清T、FINS水平異常升高判定為造模成功。將造模成功大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組、荷芪散組，每組15只。正常組和模型組大鼠給予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃，二甲雙胍組給予二甲雙胍濃縮液10 mL/(kg·d)灌胃，荷芪散組給予荷芪散溶液10 mL/(kg·d)灌胃，均連續灌胃8周，期間正常喂食，每周稱體質量1次。

1.6血糖、血脂及性激素指標水平檢測 實驗結束時取血，酶學方法檢測空腹血糖(FPG)、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，放射免疫法檢測FINS、LH、FSH、T水平，按公式計算穩態模型胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=(FPG×FINS)/22.5。

1.7卵巢組織HE染色 大鼠取血后處死， 每組中隨機取10只大鼠卵巢小塊薄組織(1 cm×0.5 cm×0.3 cm)于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。隨后經70%，80%，90%，100%乙醇逐級脫水，脫水程序為70%乙醇15 min，80%，90%，95%乙醇中各30 min，100%乙醇2 h并重復1次。用25%，50%，70%，90%二甲苯-無水乙醇透化各1 h。將標本浸入熔融的石蠟中浸蠟4 h，用加溫的鑷子將浸蠟的組織放入熔蠟中包埋，調整材料位置，待其移浮于水面并完全聚合。于旋轉切片機上制備4 μm厚縱向切片，隨后進行常規的HE染色觀察卵巢組織。

1.8卵巢組織中PI3K/AKT信號通路傳導分子mRNA相對表達量檢測 每組余下大鼠完整取出雙側卵巢，去除表面的脂肪組織，置入液氮內保存。RT-PCR法檢測卵巢組織中胰島素受體底物-1(IRS-1)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT-2(AKT-2)、糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、葡萄糖轉運蛋白因子-4(GLUT-4)、人第10號染色體缺失的磷酸酶(PTEN)mRNA相對表達量。用Applied Biosystems公司Prmier express軟件設計引物。IRS-1引物序列：上游為5’-GTCTCGTGGCTGGGTGGA-3’，下游為5’-GGGCTCGCAGAAGTTAGGTG-3’，長度106 bp；AKT-2引物序列：上游為5’-CCATCCTTGTGCCCGAGAC-3’，下游為5’-CACCAGTGGCACATGCAAAC-3’，長度167 bp；GSK-3β引物序列：上游為5’-GGTGAAAATGCTTGGGTCG-3’，下游為5’-TGAAGGCAGTCTGTCGTAATAGC-3’，長度176 bp；GLUT-4引物序列：上游為5’-GATCGGCTCTGAAGATGGGG-3’，下游為5’-GGAGGAAATCATGCCACCCA-3’，長度182 bp；PTEN引物序列：上游為5’-AGACCATAACCCACCACAGC-3’，下游為5’-CAGGGCCTCTTGTGCCTTTA-3’，長度143 bp。反應體系組成:板cDNA 0.5 μL,SYBR Green PCR MasterMix 10 μL,Ps、Pa各0.5 μL(10 μmol/L),滅菌雙蒸水補至20 μL。循環條件為:50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s。每次實驗均設置陰性對照。目標基因的相對表達量計算公式： 2-△△Ct=2-[(△Ct)Test-(△Ct)Control]。Ct目的為目標基因Ct值，Ct管家為管家基因Ct值。△Ct= Ct目的-Ct管家，表示各樣本目的基因相對管家基因的相對Ct值，△△Ct =(△Ct)Test-(△Ct)Control，表示處理組相對對照組進行歸化，2-△△Ct表示處理組相對對照組的相對表達量，表示目標基因相對表達倍數。

2 結 果

2.1各組大鼠糖脂代謝指標比較 模型組FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C均明顯高于正常組(P均<0.05)，HDL-C水平明顯低于正常組(P<0.05)；荷芪散組、二甲雙胍組FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C均明顯低于模型組(P均<0.05)，而HDL-C變化不明顯(P>0.05)；荷芪散組FPG、FINS、HOMA-IR與二甲雙胍組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，TG、LDL-C均明顯低于二甲雙胍組(P均<0.05)，而TC明顯高于二甲雙胍組(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠性激素指標水平比較 模型組血清LH、LH/FSH、T均明顯高于正常組(P均<0.05)，FSH明顯低于正常組(P<0.05)；荷芪散組、二甲雙胍組血清LH、LH/FSH、T均明顯低于模型組(P均<0.05)；荷芪散組LH、LH/FSH、T均明顯低于二甲雙胍組(P均<0.05)，FSH明顯高于二甲雙胍組(P<0.05)。見表2。

2.3各組大鼠卵巢組織切片HE染色情況 光鏡下觀察正常組卵巢組織結構正常，可見部分發育階段卵泡，卵泡內可見蛋白性液體，黃體結構正常，泡膜細胞層無增生現象,見圖1；模型組卵巢組織中卵泡囊性擴張，內含卵泡液，黃體數量減少，結構疏松紊亂，泡膜細胞層出現明顯增生現象，見圖2；荷芪散組、二甲雙胍組卵巢組織中囊性卵泡明顯較模型組少，黃體數量增多，排列尚規則，增生的泡膜細胞層變薄，見圖3及圖4。

表1 各組大鼠糖脂代謝指標比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與二甲雙胍組比較，P<0.05。

表2 各組大鼠性激素指標水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與二甲雙胍組比較，P<0.05。

圖1 正常組大鼠卵巢組織切片HE染色(×100)

圖2 模型組大鼠卵巢組織切片HE染色(×100)

2.4各組大鼠卵巢組織中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4、PTEN mRNA相對表達量比較 模型組大鼠卵巢組織中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相對表達量均明顯低于正常組(P均<0.05)，PTEN mRNA相對表達量明顯高于正常組(P<

圖3 荷芪散組大鼠卵巢組織切片HE染色(×100)

圖4 二甲雙胍組大鼠卵巢組織切片HE染色(×100)

0.05)；荷芪散組、二甲雙胍組大鼠卵巢組織中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相對表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，PTEN mRNA相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)；荷芪散組大鼠卵巢組織中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相對表達量均明顯高于二甲雙胍組(P均<0.05)，PTEN mRNA相對表達量明顯低于二甲雙胍組(P<0.05)。見表3。

3 討 論

表3 各組大鼠卵巢組織相關基因相對表達量比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與二甲雙胍組比較，P<0.05。

PCOS是一種因下丘腦-垂體-卵巢軸代謝紊亂引起機體代謝異常和生殖功能障礙的內分泌疾病，其發病和IR有非常緊密的聯系[3]。目前西醫對該病尚無特效療法，而中醫治療該病有一定優勢。羅金等[4]研究發現黃芪多糖聯合達英-35可有效改善PCOS患者IR和高雄激素狀態及血脂代謝，并能使患者卵巢體積減小，停藥后大部分有規律月經。相關臨床及實驗研究表明，活血化瘀和化痰藥具有促進盆腔微循環，增加子宮和卵巢血液供應，降低卵巢包膜厚度，促進排卵及黃體發育以及降低胰島素水平的作用[5-8]；補腎藥物可以通過調節下丘腦-垂體-卵巢性腺功能，降低雄激素水平及改善IR，從而逆轉卵巢多囊樣改變[9-10]。

荷芪散為深圳市中醫院經驗方，具有健脾祛濕、升清降濁、通便瘦身之效。方中黃芪補中益氣、健脾利水，為君藥；荷葉利濕化瘀，祛痰利水，升發清陽，為臣藥。決明子利水通便；制何首烏補肝益腎；山藥平補三焦，健脾益胃，填精固腎；冬瓜皮利水消腫；石菖蒲化痰瘀，消濕濁，利水濕；法半夏燥濕化痰，消痞散結；桃仁、紅花活血化瘀，通經止痛；當歸活血調經，補血止痛；仙茅、淫羊藿補腎助陽，祛風除濕；菟絲子補腎益精，養肝安胎，俱為佐使藥。全方共奏填精固腎、醒脾祛濕、行氣化痰之功,為脾腎虧虛、痰瘀互結之首選。本課題組前期研究發現，荷芪散可明顯降低肥胖患者體質量，改善脂代謝，并且能減輕代謝綜合征患者胰島素和瘦素抵抗，糾正慢性炎癥狀態，提高胰島素敏感性[11-14]。該方臨床用于PCOS合并IR患者療效較好，能顯著改善IR和內分泌紊亂。本實驗結果顯示，荷芪散組、二甲雙胍組FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、LH、LH/FSH、T均明顯低于模型組，且荷芪散組TG、LDL-C、LH、LH/FSH、T均明顯低于二甲雙胍組，而TC、FSH明顯高于二甲雙胍組；荷芪散組、二甲雙胍組大鼠卵巢組織接近正常。提示荷芪散可改善PCOS模型大鼠的糖脂代謝和卵巢組織形態，減輕IR，糾正性激素紊亂狀態。

目前研究表明IRS-1在相關信號傳導過程中優先調節MAPK/ERK途徑，并通過激活轉錄因子增加細胞周期蛋白的基因表達，促進蛋白合成和細胞增殖[15]。磷酸化的IRSs導致二聚體構象的改變，激活并活化PI3K，繼而形成PIP3，PIP3與蛋白激酶B(PKB)和重組人丙酮酸脫氫酶激酶同工酶-1(PDK-1)結合，最終活化AKT-2[16]。AKT是PI3K下游的直接靶蛋白，被PI3K激活后可以使GSK-3β發生磷酸化而失活，不能抑制糖原合成酶的活性，進而間接促進糖原合成；同時GSK通過減少IRS-1絲氨酸磷酸化，可抑制胰島素信號的傳導[17-19]。另外，在胰島素刺激下，靶細胞內的GLUT-4由細胞內的貯存室移位到細胞膜上，完成葡萄糖從細胞外向細胞內的跨膜轉運[20]。PTEN是PI3K信號通路的負調節因子，可控制顆粒細胞的增殖，控制卵巢的正常排卵功能，能夠促進PIP3轉化為PIP2，抑制蛋白激酶AKT的表達，阻斷下游信號通路。本實驗結果顯示，模型組大鼠卵巢組織中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相對表達量均明顯低于正常組，PTEN mRNA相對表達量明顯高于正常組；荷芪散組大鼠卵巢組織中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相對表達量均明顯高于模型組，PTEN mRNA相對表達量均明顯低于模型組。這說明多囊卵巢綜合征可能導致局部卵巢組織PI3K/AKT信號通路中相關重要信號傳導分子基因表達量的紊亂，而荷芪散可以重新上調IRS-1、AKT-2、GSK-3β、GLUT-4基因表達，下調拮抗因子PTEN基因表達。

綜上所述，荷芪散能通過上調局部卵巢組織PI3K/AKT信號通路中相關重要信號傳導分子如IRS-1、AKT-2、GSK-3β、GLUT-4的基因表達，下調拮抗因子PTEN的基因表達，改善PCOS模型大鼠糖脂代謝和卵巢組織形態，降低胰島素水平，減輕IR，糾正性激素紊亂狀態。

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