丙泊酚注射液的溶血、過敏及刺激試驗

王莉芳 李曉春

（陜西省食品藥品監督檢驗研究院 陜西 西安 710065）

丙泊酚注射液是臨床靜脈全麻誘導藥、“全靜脈麻醉”的組成部分或麻醉輔助藥。本品通過激活GABA受體—氯離子復合物，發揮鎮靜催眠作用。臨床劑量時，丙泊酚增加氯離子傳導，大劑量時使GABA受體脫敏感，從而抑制中樞神經系統，產生鎮靜、催眠效應。起效快，作用時間短，以2.5mg/kg靜脈注射時，起效時間為30～60秒，維持時間約10分鐘左右，蘇醒迅速。有病例使用丙泊酚注射液后發生過敏反應，包括Quincke氏水腫，支氣管痙攣、紅斑和低血壓，可引起局部注射部位疼痛，極少發生血栓和靜脈炎，個別病例藥物漏入靜脈外時，可能出現嚴重組織反應。本文對其溶血、過敏及刺激性進行研究。

1.材料

1.1 藥物與試劑

丙泊酚注射液（Ⅱ）（規格：10ml∶100mg），按供試品說明書中規定的臨床最大人用量進行給藥，劑量為2.5mg/kg。供試品原液濃度為10mg/ml，注射劑量0.25ml/kg，相當于臨床人用最高劑量。

1.2 儀器

電子天平，德國塞多利斯公司，型號：BS2202S，分度值10mg。

1.3 實驗動物

新西蘭兔（雌雄兼用）；體重：2.2～2.4kg；豚鼠：（雌雄各半）；體重：300～350g，均由西安灃渭新區實驗動物養殖場提供。實驗動物生產許可證號：SCXK（陜）2012-002；飼料：家兔全價顆粒飼料，由西安市迪樂普生物資源開發有限公司提供，生產許可證號：SCXK（陜）2014-004。

1.4 實驗環境

普通級實驗室，室溫20～25℃，相對濕度40%～55%，每小時換新風15次。實驗動物使用許可證號：SYXK（陜）2013-001。

2.方法

2.1 刺激試驗[2-4]

新西蘭兔8只，按體重、性別隨機分為2組，即供試品原液組和供試品稀釋液組：按供試品說明書中規定的臨床最大用量進行給藥[1]，劑量為2.5mg/kg。供試品原液濃度為10mg/ml，注射劑量0.25ml/kg，相當于臨床人用最高劑量，4只分別于左側耳緣靜脈以無菌操作方法靜脈注射劑量為2.5mg/kg，于右側等速等體積靜脈注射5%葡萄糖注射液。供試品稀釋液組：4只分別于左側耳緣靜脈以無菌操作方法靜脈注射用5%葡萄糖注射液1∶2稀釋的丙泊酚注射液（Ⅱ）。給藥劑量仍為臨床最大劑量2.5mg/kg，注射劑量0.76ml/kg。兩組家兔分別于右側等速等體積靜脈注射5%葡萄糖注射液。每天給藥一次，連續給藥5天。每次給藥后觀察血管及其周圍組織的變化情況，末次給藥后24h、48h、72h，及恢復期14天，病理組織學檢查：于72h處死1號、2號、3號家兔，分別于左右耳緣靜脈注射出，各取1cm長一段靜脈血管連同周圍組織，用10%的甲醛固定48h，脫水、透明、包埋，3um切片。觀察有無血栓形成、內皮損傷及炎癥變化。可逆性癥狀觀察及病理組織學取樣4號1只家兔，末次給藥觀察72h后，每天進行一般情況觀察和給藥部位血管刺激性癥狀觀察1次，連續觀察14天，觀察結束后同前述方法進行病理組織學檢查，以了解刺激性反應的可逆程度。病理學檢查結果：光學顯微鏡下觀察，兔耳給藥靜脈與對照靜脈血管均規則完整，血管壁無增厚，內皮細胞排列整齊，無血栓形成，血管周圍無明顯炎癥反應及其他病理變化。

圖1 病理學檢查光學顯微鏡圖

2.2 溶血與凝聚試驗

取兔血約20毫升，放入燒杯中，用玻璃棒輕攪10分鐘，除去纖維蛋白原，使之成為脫纖血液。加約10倍量的0.9%氯化鈉注射液，搖勻、離心，除去上清液，沉淀的紅細胞再用0.9%氯化鈉注射液同法洗滌3次，至上清液不呈紅色為止。將所得紅細胞用0.9%氯化鈉注射液稀釋成2%的混懸液，供實驗當天使用，用時搖勻。

本品說明書中相關內容：本品是一種起效迅速（30s）、短效的全身麻醉劑藥。未經稀釋的本品注射液可直接用于輸注，也可稀釋后使用，但稀釋也只能是5%葡萄糖注射液。故選用供試品原液組和供試品稀釋液組。稀釋液組采用5%葡萄糖注射液1∶2稀釋，本試驗分兩組為供試品原液組和供試品稀釋液組。進行溶血與凝聚試驗。

表1 供試品原液組溶血與凝聚試驗結果

表2 供試品稀釋液組溶血與凝聚試驗結果

圖2 原液組各管至恒溫箱溫育180min拍照（試管標號1至5分別對應0.1、0.2、0.3、0.4和0.5ml供試品原液體積試樣，標號6和7分別對應0.9%NaCl陰性組和蒸餾水陽性組）。

圖3 1∶2稀釋液組各管至恒溫箱溫育180min拍照（試管標號1至5分別對應0.1、0.2、0.3、0.4和0.5ml供試品稀釋液體積試樣，標號6和7分別對應0.9%NaCl陰性組和蒸餾水陽性組試樣）。

2.3 豚鼠主動全身過敏試驗

本品說明書中相關內容：本品是一種起效迅速（30s）、短效的全身麻醉劑藥。未經稀釋的本品注射液可直接用于輸注，也可稀釋后使用，但稀釋也只能是5%葡萄糖注射液。大多數年齡小于55歲成年人給藥量按體重約為2.0～2.5mg/kg。2014年《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》，本研究采用供試品濃度分別為3.5mg/ml，1.75mg/ml，1.4mg/ml。設高、中、低三個劑量組。高劑量組每只豚鼠腹腔注射給予供試品5mg/ kg，3.5mg/ml，相當于臨床人用最高劑量的2倍進行致敏；中劑量組每只豚鼠腹腔注射給予供試品2.5mg/kg，1.75mg/ml進行致敏，相當于臨床人用最高劑量；低劑量組每只豚鼠腹腔注射給予供試品2.0mg/kg，1.4mg/ml進行致敏，相當于臨床人用低劑量。每只豚鼠腹腔注射均給予0.5ml/只。先進行預實驗，如出現過敏反應，則逐步遞減給藥劑量。②陽性對照組：每只豚鼠腹腔注射給予1.0%新鮮雞蛋清0.5ml/只進行致敏。③陰性對照品組：每只豚鼠腹腔注射給予5%葡萄糖注射液0.5ml/只進行致敏。于第1、3、5天各致敏1次，共致敏3次。以致敏劑量的2倍進行激發各受試物每組首次致敏注射后第14天、第21天分別快速靜脈注射致敏劑量的2倍進行激發。

表3 被動皮膚過敏試驗制備抗體血清時對豚鼠體重的影響（±s，n=6）

表3 被動皮膚過敏試驗制備抗體血清時對豚鼠體重的影響（±s，n=6）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05.

組別 體重（g）致敏前 末次致敏 采血陰性對照 262.17±18.51 325.17±18.91 346.33±25.66陽性對照 299.50±29.90 295.33±22.24 293.50±17.31*低劑量組 287.83±32.96 337.83±9.75 329.83±36.58高劑量組 272.83±35.75 316.00±11.30 332.83±17.53

表4 藍斑直徑統計數據（±sD，n=6）

表4 藍斑直徑統計數據（±sD，n=6）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.

組 別注射部位藍斑直徑（mm）A B C D E F陰性對照組 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0陽性對照組 18.88±4.72** 16.75±4.19** 15.37±3.84** 14.13±3.53** 14.67±3.66** 13.60±3.40**低劑量組 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0高劑量組 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0

取體重300～400g健康豚鼠24只，分為四組，第一組為陽性對照組，注射1.0%新鮮雞蛋清0.5ml/只；第二組為陰性對照組，注射5%葡萄糖注射液0.5ml/只；第三組為供試品高劑量組供試品濃度為1.75mg/ml，相當于臨床最高量；第四組為供試品低劑量組，供試品濃度分別為1.4mg/ml相當于臨床低劑量；連續3次，分別隔日腹腔注射，于首次注射后14天、21天靜脈注射各組對應的供試液2倍量進行激發。激發后30min連續觀察可見，1%新鮮雞蛋清陽性對照組豚鼠激發后即刻出現噴嚏、咳嗽、排尿、痙攣、步態不穩等明顯反應，6只豚鼠均在激發后5min內死亡，按全身致敏性評價標準評判為“20”，屬極強陽性。丙泊酚注射液（Ⅱ）低、高劑量組豚鼠激發后即刻出現10～15min的昏迷，但蘇醒后一般狀況良好，無明顯過敏反應。5%葡萄糖注射液陰性對照組豚鼠激發后一般狀態良好，未見明顯過敏反應癥狀，供試品組豚鼠和陰性對照組豚鼠比較除供試品組豚鼠出現昏迷（本品為麻醉藥）外未見明顯差異，按全身致敏性評價標準評判為“0”，過敏反應為陰性。試驗期間豚鼠體重增長良好，供試品組與陰性對照組比較未見明顯異常。未引起豚鼠的過敏性反應。

2.4 豚鼠被動皮膚過敏試驗

分別給予豚鼠丙泊酚注射液（Ⅱ），濃度分別為1.75mg/ ml，1.4mg/ml。隔日1次，連續5次給豚鼠腹腔注射0.5ml/只致敏，末次致敏后第14天心臟采血，分離血清，并用原液和5%葡萄糖注射液稀釋成 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32六種稀釋度，給正常豚鼠背部皮內注射，4小時后靜脈注射摻入伊文思藍的供試液，30分鐘后測量注射部位皮膚內層藍斑直徑。

2.4.1抗血清的制備 取豚鼠24只，雌雄各半，體重250～350g。按體重隨機分為4組，即供試品高劑量組、供試品低劑量組、陰性對照組、陽性對照組，每組6只。每組動物分別腹腔注射0.5ml/只，隔日1次，共5次。末次致敏后14d，心臟采血，2000r/min離心10min，分離血清2周內備用，-20℃保存。

2.4.2被動致敏 采用皮內注射，給藥量為0.1ml/點。先將豚鼠固定，背部朝上，用電推剪進行脫毛，大小約8×6cm2，脫毛后每側取3個注射點，每個點之間間隔約2.5cm。將各組抗體血清分別用5%葡萄糖注射液稀釋成1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，用上述稀釋液進行皮內注射。經預試驗，激發時間在被動致敏4小時后為宜，采用足靜脈注射，給藥1次，給藥量為1ml/只，注射供試品各組或和對照品各組0.5ml加0.5ml0.8%伊文思蘭染液。激發30min后斷頭處死各組動物，剪取背部皮膚，用游標卡尺測量皮膚內層的藍色斑點的大小。以藍斑直徑作為評價，直徑大于5mm者判定為陽性，不規則斑點的直徑為長徑與短徑之和的一半[5]。

提供各項實測的具體數據，豚鼠體重、藍斑直徑屬于計量資料并符合正態分布，采用SPSS 13.0單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行統計。

2.5 數據處理

采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，實驗數據均以（±s）表示，用ANOVA進行統計學檢驗，P＜0.05視為差異有統計學意義。

3.討論

丙泊酚的藥理作用已有廣泛的研究報道，但對其安全性的研究還很少，加上近幾年麻醉意外增多，丙泊酚新劑型的開發方興未艾。大豆油做賦形劑1%和2%傳統丙泊酚乳劑是目前最常用的劑型。因此劑型支持細菌生長，所以在常規劑型中加入了EDTA(已二胺四醋酸)或亞硫酸鹽作為抗菌成份。目前抗菌成分的選擇仍存在爭議。因為EDTA和亞硫酸鹽可以引起過敏反應，尤其對特發行哮喘病人。應用含有EDTA或亞硫酸鹽的丙泊酚在年齡≥40、長期吸煙患者可導致全肺阻力增加，但肺泡充盈壓力變化不明顯。結果提示亞硫酸鹽對氣道高反應性患者可至氣管支氣管平滑肌收縮引起肺血管阻力增加。亞硫酸鹽可促進大豆油脂肪乳劑的脂酯過氧化反應，注射過程中可使丙泊酚注射液變成淺黃色。另外還可以降低丙泊酚乳劑的pH值，使丙泊酚乳劑“水包油”結構不穩定，增加丙泊酚乳劑分子數量和直徑增加。丙泊酚乳劑是否加入抗菌添加劑目前仍有爭議。歐洲國家臨床應用的是無任何抗菌添加劑的丙泊酚乳劑。如果在丙泊酚配置過程中能嚴格無菌操作、對開瓶抽取后的丙泊酚正確保存，細菌污染將減少到最低限。有作者建議，對伴有呼吸功能衰竭、需長時間鎮靜的危重病人，抗菌配方乳劑仍是較好選擇。

所以，有必要進行丙泊酚注射液的溶血、過敏和刺激反應的研究。丙泊酚注射液在本實驗條件下,在臨床擬用濃度（2.5mg/ kg）下，體外沒有溶血作用和凝聚反應。豚鼠注射臨床濃度（1.75mg/ml）丙泊酚注射液后，不引起豚鼠全身過敏反應。丙泊酚注射液1.75mg/ml、1.4mg/ml，對豚鼠均無被動皮膚過敏反應。在臨床擬用濃度（2.5mg/kg）原液下，丙泊酚注射液對兔耳血管均無刺激作用。

[1]化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則.北京:國家食品藥品監督管理局藥品審評中心,2014.

[2]袁伯俊,廖明陽,李波.藥物毒理學實驗方法與技術[M].北京:化學工業出版社.2007:255-256.

[3]朱玉云，高允生，成立軍等.利巴韋林葡萄糖注射液的安全性評價[J]. 泰山醫學院學報,1999,20(3):199-201.

[4]李學蘭,姜隆梅,張紅等.乳糖酸紅霉素藥物濃度和給藥次數對血管刺激性的影響[J].泰山醫學院學報,2002,23(3):227-228.

[5]國家食品藥品監督管理局.中藥、天然藥物免疫毒性(過敏性、光過敏反應)研究的技術指導原則[M].北京:中國醫藥科技出版社,2005.