過表達酵母PAC1增強轉基因大豆對大豆花葉病毒的抗性

牛陸，趙倩倩，楊靜，邢國杰，張偉，賀紅利，楊向東

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過表達酵母增強轉基因大豆對大豆花葉病毒的抗性

牛陸，趙倩倩，楊靜，邢國杰，張偉，賀紅利，楊向東

（吉林省農業科學院農業生物技術研究所/吉林省農業生物技術重點實驗室， 長春 130033）

【目的】大豆花葉病毒（，SMV)病是中國大豆產區最主要的病害之一，嚴重影響大豆產量和籽粒品質。核糖核酸酶PAC1能夠識別和降解植物RNA病毒或類病毒復制過程中產生的dsRNAs，從而有效抑制病毒在寄主中的復制與積累。PAC1的這一特點為廣譜抗RNA病毒及類病毒轉基因作物的創制和培育提供了有效的靶標基因。本研究利用轉基因技術，將來源于粟酒裂殖酵母菌()的導入栽培大豆，研究過表達對大豆SMV抗性的影響，為抗SMV轉基因大豆新品種選育提供依據。【方法】采用酶切連接技術，將連接到雙元表達載體pCAMBIA3300中，構建植物表達載體pCAMBIA3300-PAC1。目的基因啟動子為組成型強啟動子，終止子為，篩選標記為草銨膦抗性基因。采用農桿菌介導轉化法，將導入栽培大豆品種Williams82。在利用PAT/試紙、PCR及除草劑（500 mg·L-1Basta）噴施檢測基礎上，通過Southern雜交技術進一步分析外源基因在轉基因大豆中的整合情況和拷貝數。采用人工摩擦接種法，對T2和T3代轉基因大豆株系進行田間抗SMV鑒定農藝性狀調查，分析轉基因大豆對SMV抗性及遺傳穩定性。并利用qRT-PCR技術分析接種SMV 28 d后轉基因大豆中SMV積累水平。【結果】共轉化2 600多個外植體，獲得耐草銨膦（5 mg·L-1）大豆再生植株76株。PCR檢測結果表明，其中65株能夠擴增出目的條帶，大豆遺傳轉化效率為2.48%。對T1—T3代轉基因大豆株系噴施除草劑表明，在500 mg·L-1Basta處理7 d后，轉基因植株表型沒有明顯變化，而對照（非轉基因大豆）植株葉片則黃化枯死。Southern雜交結果表明，外源基因以低拷貝的方式(1—2個)整合至大豆基因組中。摩擦接種SMV SC-3鑒定表明，在接種35 d后，對照出現嚴重花葉、皺縮等典型SMV發病癥狀，而轉基因大豆僅部分葉片表現出輕微的花葉癥狀，其病情指數降低至11.11—22.22，較對照（病情指數36.81—46.24）顯著降低，且SMV抗性在轉基因大豆不同代際間能夠穩定遺傳。qRT-PCR分析表明，在接種SMV SC-3株系28 d后，轉基因大豆中SMV表達水平較對照極顯著下降。農藝性狀調查表明，在未接種SMV條件下，轉基因大豆在葉形、花色、種皮色、種臍色、株高、節數、結莢高度、生育期及百粒重等方面與對照沒有顯著差異。【結論】過表達顯著抑制了SMV的積累及癥狀發展，增強了轉基因大豆對SMV的抗性水平。

大豆；大豆花葉病毒；；農桿菌介導轉化；抗性

0 引言

【研究意義】大豆花葉病毒（，SMV）病是中國大豆產區最主要的病害之一，嚴重影響大豆產量和籽粒品質，一般年份可造成大豆產量損失10%—30%，嚴重年份或地區甚至造成大面積絕產[1-2]。SMV主要通過受侵染的種子或由蚜蟲以非持久性的方式傳播，在生產上易造成流行性危害。抗病品種的選育是控制SMV最為經濟、有效的措施。轉基因技術為廣譜、抗性持久的大豆新品種培育提供了強有力的手段。【前人研究進展】目前，在大豆資源中已鑒定出3個控制SMV抗性的顯性位點（independent single-dominant SMV resistance loci，gene），包括、和，分別位于大豆F、B2和D1b連鎖群[3-5]。盡管基因可以有效控制SMV的發生，但由于基因的廣泛應用造成的正向選擇壓力，易導致新型SMV株系的出現和原有品種抗性的逐漸喪失。目前已發現多個SMV株系對、和產生抗性[6-9]。Choi等[6]研究表明，部分SMV變異株系甚至可抵制目前已知所有等位基因和和產生抗性。SMV基因組的廣泛變異以及與其他病毒基因組之間的重組，導致新型強致病力SMV株系的不斷出現[10-15]。Yang等[16]對中國境內采集的206個病毒株和589個SMV樣本分析表明，新型重組花葉病毒（recombinant，SMV-R）出現頻率達到16.7%—60.0%。因此，培育廣譜、抗性持久的大豆新品種對于有效控制SMV危害，保障中國大豆持續穩產具有重要意義。來源于粟酒裂殖酵母（）的基因編碼由364個氨基酸組成的雙鏈RNA（double- stranded RNA，dsRNA）降解酶。研究表明，PAC1含有dsRNA結合域和核糖核酸酶Ⅲ（RNaseⅢ）結構域，是一類依賴于dsRNA的核糖核酸酶[17]。原核表達研究表明，PAC1可以有效識別和降解dsRNAs，且對dsRNAs序列無特殊要求，對單鏈RNA（single-stranded RNA，ssRNA）則無降解活性[18]。植物RNA病毒（正鏈或負鏈RNA病毒）在復制過程中均產生dsRNA復制中間體。而對于環狀單鏈RNA類病毒來說，由于其主要以滾環模式進行復制，在復制過程中也會產生類似dsRNA的棒狀結構[19]。研究表明，PAC1能夠以非特異性的方式識別和降解上述兩類病毒復制過程中產生的dsRNAs，從而有效抑制植物RNA病毒或類病毒在寄主中的復制和積累[18]。PAC1的這一特點為廣譜抗RNA病毒及類病毒轉基因作物的創制和培育提供了有效的靶標基因。Watanabe等[20]將導入煙草，獲得的轉基因煙草不僅有效抑制煙草花葉病毒（，TMV）的侵染，同時對黃瓜花葉病毒（，CMV）及馬鈴薯Y病毒（，PVY）也具有較好的抑制效果；Sano等[21]將導入馬鈴薯中，轉基因株系對馬鈴薯紡錘塊狀類病毒（，PSTVd）的抑制效果達到33%—90%；Yan等[22]利用農桿菌介導法將成功轉入小麥，研究表明，介導對大麥黃矮病毒（，BYDV）的抗性表現出劑量效應。【本研究切入點】利用PAC1有效識別和降解植物病毒或類病毒dsRNA的特性，將來源于粟酒裂殖酵母的導入栽培大豆品種，獲得對SMV抗性顯著提高的轉基因大豆。【擬解決的關鍵問題】利用Southern blot、qRT-PCR等分子檢測技術，明確在轉基因大豆中的拷貝數及表達水平。結合田間表型調查及SMV抗性鑒定結果，為廣譜抗病毒轉基因大豆種質資源創新及新品種培育提供參考依據。

1 材料與方法

試驗于2013—2016年在吉林省農業科學院轉基因植物實驗基地（吉林省公主嶺市）完成。

1.1 材料

栽培大豆品種Williams82由筆者實驗室保存，SMV SC-3株系由吉林省農業科學院植物保護研究所提供；重組質粒pBI121-PAC1由中國農業科學院植物保護研究所李世訪研究員惠贈。雙元表達載體pCAMBIA3300-35S和根癌農桿菌（）菌株EHA105由筆者實驗室保存；大腸桿菌DH5購自北京TIANGEN公司；KOD FX高保真酶和ExMasterMix聚合酶分別購自日本TOYOBO和北京康為試劑公司；限制性內切酶I和I購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Hybood TM-N+尼龍膜和Southern雜交檢測試劑盒（DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ）分別購自美國Amersham和德國Roche公司；RNA提取試劑盒EasyPure PlantRNA Kit，反轉錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，qRT-PCR檢測試劑盒TransStart Top Green qPCR SuperMix均購自北京全式金公司；草銨膦和除草劑Basta（活性成分為草銨膦）分別購自美國Sigma公司和北京鼎國生物公司；QuickStix PAT/檢測試紙購自美國EnviroLogix公司。遺傳轉化試驗中所用的培養基基礎成分、植物激素、抗生素等均購自美國Phyto Tech和Sigma公司；引物合成委托南京金斯瑞生物有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 植物表達載體構建 根據粟酒裂殖酵母來源的序列（Genbank登錄號：AAU05314.1）設計引物PAC-F1/PAC1-R1（5′-GCATGGGAAG ATTCAAGAGGCATC-3′，5′-GCTCATCTA GCG AATTTTGAATAATCC-3′，下劃線分別為I和I酶切位點）。以重組質粒pBI121-PAC1為模板，利用KOD FX高保真酶擴增目的片段，擴增片段大小為1.1 kb。采用I/I雙酶切，將連接到雙元表達載體pCAMBIA3300-35S中，構建植物表達載體pCAMBIA3300-PAC1（圖1-A）。在構建的表達載體中，上游啟動子為組成型強啟動子，終止子為，植物篩選標記為草銨膦抗性基因。采用凍融法，將載體質粒導入農桿菌菌株EHA105以備轉化。

1.2.2 農桿菌介導大豆遺傳轉化 以大豆栽培品種Williams82為受體品種，采用農桿菌介導法進行大豆遺傳轉化[23]。用氯氣滅菌的大豆成熟種子置于萌發培養基中培養24 h。利用接種刀將萌動大豆種子沿種臍部位剖開，并在子葉節位置輕微劃傷。將外植體置于農桿菌菌液中侵染30 min后，轉至共培養基中暗培養3—4 d。然后將外植體近軸面朝上轉至誘導培養基中，于25℃，16 h光照/8 h黑暗條件下培養2周左右，此時外植體上產生綠色的叢生芽。將叢生芽轉至伸長培養基中繼續培養，培養條件同上。待抗性芽長至3—5 cm時將其切下，并用1 mg·L-1IBA浸泡30 s，然后轉至生根培養基中生根。待抗性芽長出健壯的根時，將其移栽至溫室中生長結實。

1.2.3 轉基因植株分子檢測及除草劑篩選鑒定 利用PAT/試紙對移栽至溫室中的T0代轉化再生植株進行檢測，具體檢測方法參照產品說明書。采用DNA快速提取法提取植株葉片總DNA[24]，對PAT/試紙陽性植株進行PCR檢測。檢測引物為PAC1-F2/PAC1-R2（5′-GTGGATTGATGTGAT ATCTCCACTG-3′，5′-GAAGATGGCTCCTCAATCA CAGG-3′），預期擴增片段大小為448 bp。檢測引物為BAR-F1/BAR-R1（5′-GCACCATCGTCAACC ACTACATCGAG-3′，5′-TGAAGTCCAGCTGCCAGA AACCCAC-3′），預期擴增片段大小為441 bp。PCR擴增條件為95℃5 min；94℃30 s，58℃45 s，72℃1 min，共35個循環；72℃延伸10 min。對T1—T3代轉基因株系采用除草劑噴施和PCR進行鑒定篩選。待大豆幼苗長出第一組三出復葉時，噴施500 mg·L-1Basta，7—14 d后拔除對除草劑Basta敏感的植株。對耐除草劑大豆植株進行PCR檢測，檢測引物及擴增條件同上。獲得的抗Basta且PCR陽性株系用于后續試驗。

1.2.4 轉基因植株Southern雜交檢測 選取T2代PCR陽性植株進行Southern雜交檢測。采用高鹽CTAB法提取轉基因大豆和對照品種葉片總DNA[25]。利用Ⅰ酶切基因組總DNA（~50 μg），并轉移至Hybood TM-N+尼龍膜上。根據載體pCAMBIA3300- pac1中基因序列設計引物（引物序列同上），擴增探針模板。利用DIG隨機引物標記試劑盒標記探針，探針制備及雜交程序根據試劑盒說明書進行。

1.2.5 SMV田間抗性鑒定及表型調查 采用人工摩擦接種法，對T2和T3代轉基因大豆株系進行抗SMV鑒定。鑒定株系為黃淮和長江流域流行SMV株系SC-3[10]。每個株系種植3壟，每壟30株，隨機區組設計，重復3次。待大豆第一對真葉完全展開時，進行人工摩擦接種，期間進行滅蚜處理1—2次。接種35 d后進行SMV抗性調查。參照智海劍等[26]提出的SMV病情分級標準，計算病情指數（disease index，DI）。SMV抗性分級標準為高抗（HR）：無可見發病癥狀，病情指數為DI=0；抗病（R）：病情指數為0＜DI≤20；中抗（MR）：病情指數為20＜DI≤35；中感（MS）：病情指數為35＜DI≤50；感病（S）：病情指數為50＜DI≤70；高感（HS）：DI＞70。

在未接種SMV條件下，對T3代轉基因大豆株系進行農藝性狀調查，調查內容包括生育期（MP）、株高（PH）、分枝數（BN）、節數（NN）、葉形（LS）、花色（FC）、結莢高度（PoH）、種皮顏色（SCC）、種臍色（HC）和百粒重（100SW）。

1.2.6 SMV表達分析 選取接種SMV 28 d 后大豆葉片，利用EasyPure Plant RNA Kit提取總RNA。采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。SMV檢測引物為CP-F1/CP-R1（5′-GCCTTTCAGT ATTTTCGGCG-3′，5′-TACTGAGGAATTTGAGAGAT AGAGAGC-3′）。內標基因（GenBank登錄號：BW652479）檢測引物為GmACT-F1/GmACT- R1（5′-ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC-3′，5′-GC TGGTCCTGGCTGTCTCC-3′）。采用TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒進行qRT-PCR檢測，反應程序為94℃30 s；94℃5 s，60℃30 s，72℃10 s，共40個循環。根據內參基因表達量，計算目標基因相對表達量（2?ΔΔCt），每個樣品重復3次。

1.2.7 數據分析 采用SPSS（v.17.0）軟件對轉基因株系與對照在抗性水平及表型性狀的差異顯著性進行-檢驗（=0.05或0.01）。

2 結果

2.1 轉PAC1大豆的獲得及分子檢測

采用農桿菌介導法，將粟酒裂殖酵母來源的dsRNA降解酶基因導入大豆栽培品種Williams82。共轉化2 600多個外植體，經分化、篩選和再生，獲得耐草銨膦（5 mg·L-1）大豆再生植株76株。PAT/試紙和PCR檢測結果表明（圖1-B、1-C），其中65株能夠擴增出目的條帶，擴增條帶大小為448 bp，擴增條帶大小為441 bp，與預期大小一致，而對照則沒有相應的擴增條帶，表明外源基因已導入受體大豆品種。本試驗條件下，大豆遺傳轉化效率為2.48%。獲得的轉基因植株移栽至溫室中后均能夠正常開花結實，且在表型上與對照無明顯差異。

對T1—T3代轉基因大豆株系噴施除草劑表明，在500 mg·L-1Basta處理7 d后，對照非轉基因大豆植株葉片出現明顯的葉片黃化或枯死現象，而轉基因植株則表現正常（圖1-D）。對耐除草劑轉基因大豆進行PCR跟蹤檢測表明，外源基因在轉基因大豆不同代際間能夠穩定遺傳。

2.2 外源基因整合及拷貝數分析

對T2代轉基因大豆植株進行Southern雜交檢測表明，轉基因大豆植株均可以檢測到雜交信號，且雜交片段均大于3.24 kb（表達載體中I位點至左邊界序列），而對照非轉基因大豆則沒有雜交條帶出現，表明外源基因片段已整合到大豆基因組中（圖2）。在檢測的4個轉基因大豆植株中，外源T-DNA插入拷貝數為1—2個，其中L04和L16為2個拷貝，L27和L58為1個拷貝。

A：植物表達載體pCAMBIA3300-PAC1 T-DNA區示意圖，短線段表示Southern雜交探針位置，箭頭表示PAC1和BAR PCR檢測引物退火位置Schematic representation of the T-DNA region in the vector construct pCAMBIA3300-PAC1, solid bar represents probes used for Southern blot analysis, small arrows indicate primers annealing on the construct for PAC1 and BAR gene amplification。B：T0代轉基因植株PAT/BAR試紙檢測LibertyLink strip analysis of the T0 transgenic plants；NT：非轉化植株non-transformed plants；1—10；T0代轉基因植株T0 transgenic plants。C：T0代轉基因植株PCR檢測PCR detection of the T0 transgenic plants，M：DNA marker (2 kb)；Ctl+：陽性對照質粒positive control；NT：非轉化植株non-transformed plants；Bk：空白H2O對照blank control；1—4；PAT/BAR試紙陽性植株LibertyLink strip positive transgenic plants。D：T2代轉基因株系除草劑Basta（500 mg·L-1）篩選Screening of the T2 transgenic lines with 500 mg·L-1 Basta，NT：非轉化大豆Willams82 wild type Willams82；L27：T2代轉基因株系T2 transgenic lines

M：DNA marker (15 kb)；Ctrl+：陽性對照pCAMBIA3300-PAC1 positive control；NT：非轉化植株non-transformed plants；L04、L16、L27、L58：T2代轉基因大豆植株T2 transgenic plants；總DNA（~50 μg）用Xba I完全酶切后，利用BAR基因探針進行雜交檢測About ~50 μg of the total DNA was digested completely with the restriction endonuclease Xba I and hybridized against the BAR probe

2.3 PAC1過表達增強轉基因大豆SMV抗性

采用人工摩擦接種法對T2—T3代轉基因大豆株系進行田間抗SMV鑒定。結果表明，接種SMV SC-3株系35 d后，對照非轉基因植株葉片出現嚴重花葉、皺縮等典型SMV發病癥狀，而轉基因大豆植株僅部分葉片出現輕微花葉癥狀，且大部分葉片均無明顯的SMV癥狀（圖3），表明過表達顯著抑制了SMV的癥狀發展。連續2代抗性鑒定結果表明，鑒定的4個轉基因大豆株系L04、L16、L27、L57病情指數在11.11—22.22，顯著低于對照品種Williams82（病情指數為36.81—46.24），表明轉基因大豆SMV抗性水平較對照受體品種顯著提高。在鑒定的4個轉基因大豆株系中，其中L27病情指數最低，且連續2代抗性鑒定病情指數均為11.11，對SMV表現出穩定的抗性水平。在人工接種條件下，T3代轉基因大豆L04和L16及對照品種Williams病情指數較T2代有所提高（表1），其原因可能是由于SMV通過種子在不同世代中積累的緣故。

NT：非轉基因大豆Williams82 non-transformed control plants (Williams82)；L04、L16、L27、L58、L96：T3代轉基因大豆株系T3 transgenic lines

表1 T2和T3代接種SMV抗性鑒定結果

NT：非轉基因大豆Williams82 non-transformed control plants (Williams82)；L04、L16、L27、L58：轉基因大豆株系transgenic lines；*表示在＜0.01水平上各轉基因株系與對照受體品種存在極顯著差異 * indicates significant differences between each transgenic line and the NT control plants at＜0.01 level

主要農藝性狀調查結果表明，在未接種SMV條件下，4個轉基因大豆株系與對照受體品種在葉形、花色、種皮色、種臍色、株高、節數、結莢高度、生育期、百粒重等方面沒有顯著差異（表2），表明外源整合及表達對轉基因大豆沒有造成非特異性影響。

2.4 PAC1過表達抑制SMV基因表達及積累

為進一步分析SMV在轉基因大豆中的表達和積累，采用qRT-PCR技術對T2代轉基因大豆中SMV的表達進行了分析。結果表明，在接種SMV 28 d后，轉基因大豆表達較對照品種極顯著下降，表明過表達顯著抑制SMV基因在大豆中的表達及積累，這與田間抗性鑒定結果相一致（圖4）。

NT：非轉基因大豆Williams82 non-transformed control plants (Williams82)；L04、L16、L27、L58：T2代轉基因大豆株系T2 transgenic lines

3 討論

由于SMV與寄主、環境之間的互作，病毒基因組之間的重組和變異以及大豆基因的廣泛應用造成的強烈選擇壓力，造成新型SMV株系不斷出現[1-2]。特別是隨著國內外大豆種質資源交流的日益頻繁，這一趨勢將日益明顯。轉基因技術為廣譜、抗性持久的大豆新品種培育提供了強有力的手段。已有的研究表明，利用宿主介導RNAi技術，沉默單個或多個病毒基因，可以顯著提高植物抗多種病毒水平，部分轉基因株系可以達到高抗或接近免疫水平[27-28]。PAC1作為一類依賴于dsRNA的核糖核酸酶，可以以非特異性的方式，有效降解植物RNA病毒或類病毒在復制過程中產生的dsRNAs，從而有效抑制病毒在寄主中的復制和積累[11]，為廣譜抗RNA病毒研究提供了有效的靶標基因[29-31]。本研究將來源于粟酒裂殖酵母的導入栽培大豆品種，獲得了對中國黃淮和長江流域SMV主要流行株系SC-3抗性顯著提高的轉基因大豆。接種鑒定表明，轉基因大豆葉片僅表現出輕微的花葉癥狀或無明顯SMV癥狀，且病情指數較對照品種極顯著下降。qRT-PCR檢測結果也顯示，轉基因大豆中SMV表達水平極顯著下降，表明過表達顯著抑制了SMV積累以及SMV癥狀的發展，從而提高了大豆SMV抗性水平。但本研究僅分析了轉大豆對SMV SC-3株系的抗性，在后續研究中，將進一步分析轉大豆對其他SMV株系或病毒類型如菜豆莢斑駁病毒（，BPMV）的抗病譜。

表2 轉基因大豆主要農藝性狀表現

另一方面，盡管過表達限制了SMV癥狀的發展，但其抗性效果并沒有達到高抗或免疫水平，其原因可能與轉基因大豆中表達水平有關。Yan等[22]研究表明，對病毒抗性存在劑量效應。由于PAC1對SMV復制過程中產生dsRNAs降解低于病毒本身復制速度，或是由于SMV在宿主中以單鏈正義RNA形式存在，因此，病毒在轉基因大豆中仍有一定程度的積累，并在部分葉片上產生輕微的花葉癥狀。

已有的研究表明，PAC1可以有效識別和降解長鏈dSRNAs或小發夾RNA分子[21]。在植物細胞中，由于RNA分子間或分子內的序列互補性，會形成類似dsRNA或小發夾RNA的結構[32]，因此，PAC1是否會降解植物內源dsRNA或小發夾RNA分子，從而對植物體內正常代謝過程產生非特異性的影響，目前國內外尚沒有這方面的報道。不過在本試驗條件下，過表達并沒有對轉基因大豆農藝性狀產生明顯影響。關于PAC1對植物內源基因表達及代謝過程的影響還需進一步深入研究。

4 結論

過表達顯著抑制了大豆花葉病毒（SMV）的積累及癥狀發展，增強了轉基因大豆對SMV的抗性水平。在未接種SMV條件下，表達對轉基因大豆沒有非特異性影響。

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（責任編輯 岳梅）

Over-Expression of Yeastconfers enhanced resistance toin transgenic soybean

NIU Lu, ZHAO QianQian, YANG Jing, XING GuoJie, ZHANG Wei, HE HongLi, YANG XiangDong

(Agro-Biotechnology Institute, Jilin Academy of Agricultural Sciences/Jilin Provincial Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Changchun 130033)

【Objective】(SMV) is one of the most prevalent viral diseases in major soybean growing areas of China and cause significant yield losses and quality deterioration of soybean seeds. Ribonuclease PAC1 was known to bind and degrade the dsRNA molecules generated during plant RNA viruses or viroids replication, thus effectively inhibited replication and accumulation of viruses or viroids in host plants. This feature of PAC1 provides an effective target gene for the creation and cultivation of the broad-spectrum anti RNA virus and viroid transgenic crops. The objective of thisstudy is to introduce aderived frominto soybean by transgenic technique, research the effects of over-expression ofonSMV resistance of soybean, and to provide a basis for the development of SMV-resistant soybean cultivars. 【Method】Thewas subcloned into the binary expression vector pCAMBIA3300 by restriction enzyme digestion and ligation to generate recombinant construct pCAMBIA3300-PAC1. In the resulting construct, thewas located between the constitutive promoterand the terminatorThe construct also contained awhich confers resistance to the herbicide phosphinothricin(PPT). The soybean cultivar Williams82 was used for-mediated transformation. Based on the detection of LibertyLink?strip, PCR and herbicide spray (500 mg·L-1Basta), the integration and copy numbers of the exogenous gene in transgenic lines were further analyzed by Southern blot hybridization. Mechanical rub inoculation was performed to evaluate the resistance of the T2and T3transgenic lines and agronomic traits were analyzed under field conditions. Furthermore, the accumulation of SMV in the transgenic lines 28 days after SMV inoculation was analyzed using qRT-PCR. 【Result】A total of 76 PPT-tolerant plants were generated from 2 600 explants after-mediated transformation. Among them, 65 regenerated plants were confirmed positive as shown by PCR and LibertyLink?strip analysis, and the transformation efficiency was 2.48%. The transgenic plants in subsequent generations (T1to T3) were further screened by spraying 500 mg·L-1Basta. The transgenic plants showed no visible phenotype change 7 days after treatment, whereas the non-transgenic (NT) plants exhibited symptoms such as chlorosis or necrosis. Southern blot analysis showed that the exogenous gene was integrated into soybean genome with 1-2 copies of T-DNA insertions in the selected transgenic plants. Resistance evaluation by rub inoculation with SMV showed that the NT plants displayed serious mosaic patterns and curling leaves, while only mild mosaic symptom was observed on some of the leaves of the transgenic plants (35 days after inoculation). Moreover, the transgenic lines had significantly lower average disease indices (11.11-22.22) than the non-transformed (NT) control plants (36.81-46.24) and showed enhanced and stable resistance to SMV. The qRT-PCR result further confirmed that the SMVexpression in the transgenic plants was significantly decreased than that of the NT control 28 days after SMV inoculation. The investigation of agronomic traits showed that there was no significant difference in the leaf shape, flower color, seed color, hilum color, plant height, node number, podding height, maturity period and weight per 100 seeds between the transgenic lines and NT control plants without inoculation SMV. 【Conclusion】The over-expression ofsignificantly inhibited the accumulation of SMV and the development of the symptoms, thus enhancing the resistance level to SMV in transgenic soybean plants.

soybean;(SMV);;-mediated transformation; resistance

2017-06-12；

2017-08-23

國家轉基因生物新品種培育科技重大專項（2016ZX08004-004）、吉林省農業科技創新工程（CXGC2017JQ013，C6215000210）

牛陸，Tel：0431-87063097；E-mail：niulu_0711@163.com。

楊向東，Tel：0431-87063044；E-mail：xdyang020918@126.com