番茄U6啟動(dòng)子的克隆及CRISPR/Cas9基因編輯體系的建立

蒲艷，劉超，李繼洋，阿爾祖古麗·塔什，胡燕，劉曉東

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番茄啟動(dòng)子的克隆及CRISPR/Cas9基因編輯體系的建立

蒲艷，劉超，李繼洋，阿爾祖古麗·塔什，胡燕，劉曉東

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830052）

【目的】從番茄中克隆高效轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯載體，并在番茄中建立CRISPR/Cas9系統(tǒng)，為番茄功能基因組學(xué)和分子育種研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。【方法】采用PCR方法從‘中蔬四號(hào)’番茄品種中克隆4種啟動(dòng)子，利用Transfer PCR方法分別對(duì)4個(gè)啟動(dòng)子進(jìn)行兩種不同長(zhǎng)度的截短，分別構(gòu)建8個(gè)截短的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物融合表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)染番茄葉片，通過染色篩選出在番茄葉片中轉(zhuǎn)錄活性較高的-2啟動(dòng)子。采用DNA重組技術(shù)構(gòu)建以-2為啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA，以番茄白粉病相關(guān)基因和為靶序列的CRISPR/Cas9基因組編輯載體。載體構(gòu)建成功后，采用PEG法轉(zhuǎn)化番茄原生質(zhì)體，提取基因組DNA，采用酶切/PCR法分析內(nèi)源基因突變情況；采用測(cè)序法分析內(nèi)源基因突變的類型。利用突變位點(diǎn)頻率分布圖來驗(yàn)證番茄內(nèi)源啟動(dòng)子在番茄CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的有效性?！窘Y(jié)果】經(jīng)過兩輪PCR，共獲得4種8個(gè)不同長(zhǎng)度的番茄啟動(dòng)子，其長(zhǎng)度分別是452、202、448、206、433、190、448和218 bp，啟動(dòng)子序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)番茄啟動(dòng)子與擬南芥啟動(dòng)子一樣，也含有比較保守的兩個(gè)元件，USE和TATA框。成功構(gòu)建了8個(gè)啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)的植物融合表達(dá)載體。番茄葉片染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化后的番茄葉片均被染成藍(lán)色，表明克隆的番茄8個(gè)啟動(dòng)子均具有轉(zhuǎn)錄活性。選擇-2P4為啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA，成功構(gòu)建番茄白粉病相關(guān)基因和為靶序列的CRISPR/Cas9基因組編輯載體，驗(yàn)證結(jié)果表明番茄內(nèi)源啟動(dòng)子-2P4能有效地驅(qū)動(dòng)sgRNA的轉(zhuǎn)錄，并成功實(shí)現(xiàn)對(duì)番茄內(nèi)源基因的編輯。內(nèi)源基因突變的類型都為堿基替換，突變熱點(diǎn)僅存在于內(nèi)源基因靶序列區(qū)。【結(jié)論】成功克隆了4種在番茄葉片中高效轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；基于-2啟動(dòng)子的CRISPR/Cas9基因組編輯載體，在番茄中成功實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源基因的編輯。

CRISPR/Cas9；啟動(dòng)子；克??；番茄；基因編輯

0 引言

【研究意義】2012年由14個(gè)國(guó)家共同完成了番茄全基因組測(cè)序工作，預(yù)測(cè)番茄共有3.4×104—3.5×104個(gè)編碼蛋白的基因[1]，然而絕大多數(shù)基因的功能并不清楚?；蚓庉嫾夹g(shù)是近幾年興起的一項(xiàng)能對(duì)基因組完成精確修飾的技術(shù)，可完成基因定點(diǎn)堿基替換、敲入或小片段的缺失等，從而可為番茄基因功能的研究提供優(yōu)良的突變體遺傳材料，為今后番茄功能基因組學(xué)和分子育種方面的研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前常見的基因編輯技術(shù)主要有鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs)[2]、TALEN核酸酶（transcription activator like effector nucleases，TALENs)[3]和CRISPR/Cas（規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列，clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein）[4]3種技術(shù)體系。CRISPR/Cas9系統(tǒng)于2013年興起，因其操作簡(jiǎn)單、效率高、脫靶效率低等特點(diǎn)受到了全世界的廣泛研究。TypeII型CRISPR/Cas系統(tǒng)是由一個(gè)單鏈向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）和一個(gè)具有靶向識(shí)別sgRNA的核酸酶Cas9組成，這兩種成分共同介導(dǎo)了靶位點(diǎn)的切割，進(jìn)而引起靶位點(diǎn)的突變，它是目前應(yīng)用最為廣泛的一個(gè)基因編輯系統(tǒng)，目前已成功運(yùn)用于多種植物體中[5-7]。RNA是一種小的非編碼RNA，廣泛參與mRNA前體的剪接成熟，其對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)sgDNA的轉(zhuǎn)錄并且是CRISPR-Cas9系統(tǒng)中重要的元件之一[8-12]，在真核生物中，啟動(dòng)子發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄功能的兩個(gè)重要元件是USE和TATA框[13]。劉玟彬等[14]用擬南芥啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)兩個(gè)sgRNA，成功實(shí)現(xiàn)了擬南芥5序列內(nèi)大片段的缺失。XING等[15]運(yùn)用擬南芥啟動(dòng)子在玉米和擬南芥中成功實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源基因的編輯。LI等[16]克隆擬南芥啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA，成功在擬南芥中實(shí)現(xiàn)了靶基因和的突變。【本研究切入點(diǎn)】雖然已報(bào)道許多不同物種的啟動(dòng)子，在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中成功得到了應(yīng)用，但同樣的啟動(dòng)子在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)物種中不一定適用，到目前為止，適用于番茄的內(nèi)源啟動(dòng)子并無研究報(bào)道。生物信息學(xué)分析顯示，番茄中至少含有10個(gè)啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子是否都具有轉(zhuǎn)錄功能并不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】克隆具有高效轉(zhuǎn)錄活性的番茄內(nèi)源啟動(dòng)子并構(gòu)建相應(yīng)的CRISPR/Cas9編輯載體，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化番茄原生質(zhì)體來實(shí)現(xiàn)對(duì)番茄內(nèi)源基因的編輯，在番茄中建立有效的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016—2017年在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用載體質(zhì)粒-5P2::、農(nóng)桿菌GV3101、番茄‘中蔬四號(hào)’均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶購(gòu)于Thermo公司；EasyPure植物基因組DNA提取試劑盒、T4 DNA連接酶、Blunt Zero載體、Trans5α感受態(tài)細(xì)胞、1 kb Plus DNA Ladder等均購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)公司；Phusion超保真DNA聚合酶購(gòu)于北京NEB公司。測(cè)序及引物合成均由上海杰李生物科技有限公司完成。

1.2 番茄不同SlU6-2P、SlU6-3P、SlU6-4P、SlU6-9P啟動(dòng)子的克隆

將番茄（)品種‘中蔬四號(hào)’播種于含蛭石與營(yíng)養(yǎng)土的土壤中，取生長(zhǎng)3—4周的幼苗葉片，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取番茄基因組DNA，用保守的RNA序列在番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.phytozome.net/）中搜索候選RNA對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子序列，并設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物（表1）。本所采用兩輪PCR的方法，第1輪PCR采用Phusion超保真DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 4 min；98℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃150 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min；反應(yīng)體系為ddH2O 11 μL、5×Phusion buffer 4 μL、2.5 mmol?L-1dNTP 1.6 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL、Phusion超保真DNA聚合酶0.4 μL，共20 μL體系。獲得的啟動(dòng)子片段分別命名為-2P、-3P、-4P和-9P，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后，Quick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒回收并純化目的DNA片段。回收完成后與平端載體B-Zero連接、轉(zhuǎn)化，對(duì)重組質(zhì)粒用Ⅰ進(jìn)行酶切鑒定，正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，隨后用MegAlign軟件對(duì)測(cè)序的質(zhì)粒進(jìn)行序列比對(duì)分析，第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序正確的質(zhì)粒用作模板再進(jìn)行第2輪PCR。

表1 本研究中使用的引物序列

下劃線為受體質(zhì)粒部分堿基序列

Underlined sequences are the part of receptor plasmid partial nucleotide sequence

第二輪采用Transfer PCR[17]的方法，使用Phusion超保真DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，克隆不同截短的-2P、-3P、-4P、-9P啟動(dòng)子。先根據(jù)第一輪測(cè)序正確的4個(gè)啟動(dòng)子序列和-5P2::載體序列各設(shè)計(jì)2對(duì)引物（表1）。以-5P2::的質(zhì)粒為受體質(zhì)粒，-2P、-3P、-4P、-9P啟動(dòng)子的質(zhì)粒為供體質(zhì)粒進(jìn)行Transfer PCR，反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性1 min；95℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸90 s，13個(gè)循環(huán)；95℃變性30 s，67℃退火1 min，72℃延伸4 min，20個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。反應(yīng)體系為ddH2O 32.7 μL、5×Phusion buffer 10 μL、2.5 mmol?L-1dNTP 2.5 μL、上下游引物各1 μL、供體質(zhì)粒和受體質(zhì)粒模板各1 μL、Phusion超保真DNA聚合酶0.8 μL，共50 μL體系。對(duì)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確的Transfer PCR產(chǎn)物進(jìn)行Ⅰ酶切處理，酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，用HⅠ和Ⅰ酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，用MegAlign軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，正確的質(zhì)粒命名為T-Ps。

1.3 SlU6啟動(dòng)子序列分析

運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)擬南芥及已克隆的番茄候選的啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4 不同截短SlU6Ps::GUS-sgRNA-P1300融合表達(dá)載體的構(gòu)建

用Ⅲ和Ⅰ雙酶切番茄啟動(dòng)子不同截短的T--2Ps、T--3Ps、T--4Ps、T--9Ps質(zhì)粒以及植物表達(dá)載體pCAMBIA 1300，分別回收目標(biāo)片段并用T4連接酶連接、轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)重組質(zhì)粒用Ⅲ和Ⅰ進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為Ps::-sgRNA-P1300，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，28℃倒置培養(yǎng)2 d后，挑取克隆于LB液體培養(yǎng)基（Kan 50 μg·mL-1，Rif 25 μg·mL-1）培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后提取質(zhì)粒再次用Ⅲ和Ⅰ酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒和農(nóng)桿菌菌液置于-20℃保存。番茄不同Ps::-sgRNA-P1300融合表達(dá)載體示意圖見圖1。

1.5 不同截短SlU6Ps::GUS在番茄葉片中的瞬時(shí)表達(dá)分析

將構(gòu)建好的番茄不同-Ps::GUS-sgRNA- P1300 融合表達(dá)載體以及陽(yáng)性對(duì)照pCAMBIA1304，陰性對(duì)照pCAMBIA1300植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌分別按照1﹕100比例接種于LB培養(yǎng)基（Kan 50 μg·mL-1，Rif 25 μg·mL-1）中活化，28℃，180 r/min搖菌至菌液OD600=0.6—1.2，分別吸取不同體積的活化菌液接種到5 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1Kan和25 μg·mL-1Rif）中，使每個(gè)農(nóng)桿菌起始菌液OD值相同，再次28℃，180 r/min搖菌至所有菌液的OD600= 1.5時(shí)，12 000×離心5 min收集菌體，棄上清液，重懸于Buffer（50 mmol?L-1Mgcl2、200 mmol?L-1MES、20 mmol?L-1乙酰丁香酮）至1 mL，室溫放置3 h后分別注射到生長(zhǎng)2—3周的番茄子葉中，注射完成后每種樣品做好標(biāo)記，進(jìn)行過夜暗培養(yǎng)。用剪刀分別剪下暗培養(yǎng)過夜后的番茄葉片，浸泡在100 μl GUS染液中（0.5 mol·L-1磷酸緩沖液，pH 7.0；0.5 mol·L-1EDTA；pH 8.0；10% Triton X-100；20 mmol·L-1X-Gluc），并在-0.05 MPa下抽真空30 min。每種農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化進(jìn)行技術(shù)重復(fù)3次，生物學(xué)重復(fù)2次。

圖1 番茄不同截短SlU6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS的融合表達(dá)載體構(gòu)建

將抽完真空后的番茄葉片置于37℃，180 r/min振蕩染色6—7 h，吸盡GUS染液。最后加入300 μl 95%乙醇進(jìn)行脫色處理，脫色時(shí)，每3—4 h更換一次脫色液，直至葉片綠色褪去，最后將脫色后的葉片置于體式顯微鏡下觀察并拍照，根據(jù)染色情況篩選出在番茄葉片中高效轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。

1.6 番茄CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

采用染色較深的啟動(dòng)子構(gòu)建番茄CRISPR/Cas9基因編輯載體。根據(jù)網(wǎng)上公布的番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，以白粉病相關(guān)基因和設(shè)計(jì)引物進(jìn)行克隆測(cè)序，獲得‘中蔬四號(hào)’番茄品種和的基因組序列，每個(gè)基因設(shè)計(jì)3個(gè)靶序列，并分別構(gòu)建以和為靶位點(diǎn)的6個(gè)sgRNA（表1）。靶序列設(shè)計(jì)在PAM（5′-NGG-3′）（the protospacer-adjacent motif）位點(diǎn)前，長(zhǎng)度為24個(gè)堿基，并在PAM位點(diǎn)5′上游的切割位點(diǎn)處為限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。靶序列經(jīng)過退火（95℃每5 s降低0.5℃至20℃），通過T4連接酶連接過夜，插入到經(jīng)Ⅰ酶切的T--2p4載體相應(yīng)位置上，轉(zhuǎn)化-5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆測(cè)序鑒定帶有和靶序列的sgRNA表達(dá)載體。最終6個(gè)帶有靶位點(diǎn)的sgRNA載體測(cè)序正確后用Ⅰ和Ⅰ酶切，同時(shí)酶切Cas9載體后回收目的條帶，T4連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化-5α感受態(tài)細(xì)胞，酶切鑒定后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期目的片段大小一致，表明以-2P4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)帶有和靶序列的番茄CRISPR/Cas9載體構(gòu)建成功。

圖2 sgRNA和Cas9共表達(dá)載體的構(gòu)建

1.7 番茄原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化

將‘中蔬四號(hào)’番茄品種播種于含蛭石與營(yíng)養(yǎng)土的土壤中，選取生長(zhǎng)在短日照（12 h光照和12 h黑暗）條件下，大約2—3周的番茄子葉。準(zhǔn)備兩種黏度不同的膠帶，先用黏性較強(qiáng)的一面固定于葉片的正面，將黏性較弱的膠帶粘住背面，用手輕輕按壓，受力均勻，之后緩慢撕下黏性較弱的膠帶，下表皮會(huì)隨著膠帶而被撕去，之后葉肉細(xì)胞將裸露出來，將這一面葉片放入纖維素酶溶解液中（1.25% celluase R10，0.3% macerozyme R10，0.4 mol?L-1mannitol，20 mmol?L-1KCl，20 mmol?L-1MES，55℃，10 min）酶解，后續(xù)試驗(yàn)按文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。

在番茄原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化前對(duì)帶有靶序列的CRISPR/ Cas9載體的核心區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物見表1（TVV），擴(kuò)增片段覆蓋有或靶序列的-2p4::sgRNA及35S-Cas9-ter兩個(gè)核心元件，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后采用酚氯仿抽提和酒精沉淀法對(duì)其產(chǎn)物加以簡(jiǎn)單純化[19]。番茄原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化參見文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。

1.8 番茄EDR1和MLO1靶序列突變位點(diǎn)檢測(cè)

將轉(zhuǎn)化后孵育過夜的番茄原生質(zhì)體用植物基因組DNA提取試劑盒提取番茄基因組DNA，采用基因組DNA先酶切后PCR（Restriction Enzyme digestion/PCR，RE/PCR）的方法[16]對(duì)靶序列內(nèi)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，引物見表1（Test系列），回收初步檢測(cè)出突變的PCR產(chǎn)物，通過克隆測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析番茄和靶序列內(nèi)的突變。

1.9 靶基因內(nèi)不同區(qū)域突變頻率的計(jì)算

為了排除堿基突變是PCR過程中引入隨機(jī)突變的可能性，對(duì)酶切前的番茄基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物見表1（Test系列）。PCR產(chǎn)物克隆，選取100個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。以40個(gè)堿基為一個(gè)計(jì)算單元，對(duì)包括靶序列（263—286 bp）在內(nèi)的600 bp的PCR擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的突變進(jìn)行頻率計(jì)算，并對(duì)突變頻率分布結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 SlU6-2P、SlU6-3P、SlU6-4P、SlU6-9P啟動(dòng)子第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

從番茄‘中蔬四號(hào)’中分別成功擴(kuò)增出-2P、-3P、-4P、-9P啟動(dòng)子片段，長(zhǎng)度分別為1 347、1 385、1 258和1 253 bp。克隆后對(duì)酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明正確（圖略）。

2.2 不同截短 T-SlU6擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

以第1輪測(cè)序正確的-2P、-3P、-4P、-9P啟動(dòng)子的質(zhì)粒為供體質(zhì)粒，-5P2::的質(zhì)粒為受體質(zhì)粒進(jìn)行Transfer PCR，最終將受體質(zhì)粒-5P2::中的棉花啟動(dòng)子片段分別置換為番茄的4種8個(gè)啟動(dòng)子片段。圖3中A和B分別為T--2P4、T-2P5、T-3P4、T--3P5、T--4P4、T--4P5、T-9P4和T--9P5 Transfer PCR的電泳檢測(cè)圖，其啟動(dòng)子截短片段大小依次為452、202、448、206、433、190、448和218 bp。用Ⅲ和Ⅰ雙酶切各截短啟動(dòng)子的質(zhì)粒，結(jié)果與預(yù)測(cè)片段大小一致（圖略）。

2.3 不同截短SlU6-Ps::GUS-sgRNA-P1300融合表達(dá)載體構(gòu)建

將測(cè)序正確的不同截短Ps::-sgRNA的重組基因片段連入植物表達(dá)載體pCAMBIA1300，分別用d Ⅲ和HⅠ分別酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA1300和8個(gè)構(gòu)建成功的不同截短Ps::-sgRNA融合表達(dá)載體，回收目標(biāo)片段后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，用HⅠ和Ⅰ分別對(duì)不同Ps::-sgRNA-P1300重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，2P4::-sgRNA-P1300產(chǎn)生 630 bp和11.2 kb兩條帶；2P5::-sgRNA-P1300產(chǎn)生380 bp和11.2 Kb兩條帶；3P5::-sgRNA-P1300 產(chǎn)生390 bp和11.2 kb兩條帶；4P4::-sgRNA-P1300 產(chǎn)生510 bp和11.2 kb兩條帶；4P5::-sgRNA- P1300產(chǎn)生370 bp和11.2 kb兩條帶；9P4::- sgRNA-P1300產(chǎn)生433 bp和11.2 kb兩條帶；9P5::-sgRNA-P1300 產(chǎn)生400 bp和11.2 kb兩條帶，以上檢測(cè)結(jié)果均與預(yù)測(cè)片段大小相符（圖4）。

M: 1 kb Plus DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量 1 kb Plus DNA marker; A: 1: SlU6-2P4::GUS-sgRNA; 2: SlU6-3P4::GUS-sgRNA; 3: SlU6 4P4::GUS-sgRNA; 4: SlU6 9P4::GUS-sgRNA; B: 1: SlU6-2P5::GUS-sgRNA; 2: SlU6-3P5::GUS-sgRNA; 3: SlU6 4P5::GUS-sgRNA; 4: SlU6 9P5::GUS-sgRNA

M: 1 Kb Plus DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量1 kb Plus DNA marker; A: 1: SlU6-4P4::GUS-sgRNA-P1300; 2: SlU6-9P4::GUS-sgRNA-P1300; 3: SlU6 9P5::GUS- sgRNA-P1300;B: 1: SlU6-2P5::GUS-sgRNA-P1300; 2: SlU6-3P5::GUS-sgRNA-P1300; 3: SlU6 4P5::GUS-sgRNA-P1300; 4: SlU6 2P4::GUS-sgRNA-P1300; 5: SlU6 3P4::GUS-sgRNA-P1300

2.4 SlU6啟動(dòng)子序列分析

對(duì)已克隆的4個(gè)候選番茄啟動(dòng)子和擬南芥啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)番茄啟動(dòng)子序列也非常保守，含有不同于Pol II RNA聚合酶啟動(dòng)子位點(diǎn)的TATA box及USE（upstream sequence element）元件5′-TCCCACATCG-3′，并且這兩個(gè)元件之間的距離也比較固定（圖5）。

2.5 SlU6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定

將構(gòu)建好的不同截短Ps::-sgRNA- P1300，陽(yáng)性對(duì)照pCAMBIA 1304及陰性對(duì)照pCAMBIA 1300通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化番茄幼苗葉片。通過GUS組織化學(xué)染色分析發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌成功侵染后的番茄葉片均被染成藍(lán)色，表明克隆的8種啟動(dòng)子均能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)（圖6）。

2.6 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

以番茄-2P4為啟動(dòng)子，構(gòu)建以白粉病相關(guān)基因1和序列內(nèi)共6個(gè)靶位點(diǎn)的sgRNA，測(cè)序正確后用Ⅰ和Ⅰ酶切6個(gè)帶有靶位點(diǎn)的sgRNA載體和Cas9載體后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，最終用同樣的酶切鑒定挑取的單克隆，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)與預(yù)期目的條帶大小一致（圖7）

2.7 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的番茄EDR1和MLO1靶序列突變位點(diǎn)及突變率檢測(cè)

通過基因組DNA酶切后PCR的方法對(duì)靶序列突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，靶區(qū)域限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)突變后，限制性內(nèi)切酶就不能進(jìn)行切割，則PCR擴(kuò)增出預(yù)期產(chǎn)物，而未編輯突變的野生型對(duì)照則基本無PCR產(chǎn)物（圖8-A、B）。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆和測(cè)序。通過序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)靶位點(diǎn)發(fā)生個(gè)別堿基的替換（圖8-B）。在試驗(yàn)中未檢測(cè)到所有靶位點(diǎn)和SapⅠ靶位點(diǎn)的突變。對(duì)靶基因包括靶序列（263—286 bp）在內(nèi)的600 bp擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的突變頻率進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在靶序列處明顯出現(xiàn)一個(gè)突變峰值，其突變頻率明顯高于其他區(qū)域（圖8-D）。表明靶序列區(qū)堿基的突變確實(shí)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯的結(jié)果。

箭頭為U6 RNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) Arrow indicate the transcription start site of U6 RNA

圖6 不同截短SlU6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS在番茄葉片中的瞬時(shí)表達(dá)

M：2 kb PlusⅡ標(biāo)準(zhǔn)分子量2 kb PlusⅡDNA Marker；1：構(gòu)建SlU6-2p4- sgRNA::Cas9載體，以番茄EDR1設(shè)計(jì)3個(gè)為靶序列，1、2、3分別為帶有Bgl II、MfeⅠ、NdeⅠ酶切位點(diǎn)；4、5、6以番茄MLO1設(shè)計(jì)3個(gè)靶序列分別含有Mfe I、Sap I、Pst I酶切位點(diǎn)；1: Construct SlU6-2p4-gRNA::Cas9 vector, which have three target sequences in EDR1respectively, lanes 1, 2, 3 contains BglⅡ, MfeⅠ, NdeⅠ enzyme respectively and another three target sequences in MLO1, respectively; lanes 4, 5, 6 contains MfeⅠ, SapⅠ, PstⅠenzyme sites, respectively

上述結(jié)果證明番茄的-2P4啟動(dòng)子可以使CRISPR/ Cas9基因編輯載體系統(tǒng)在番茄中實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源基因編輯的功能。

3 討論

由RNA介導(dǎo)的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，作為一項(xiàng)全新的第三代人工核酸酶技術(shù)，其載體構(gòu)建簡(jiǎn)單、成本消耗低，目前已成功地應(yīng)用在擬南芥[16]、棉花[20]、玉米[21]、水稻[22]、煙草[23]、大豆[24]等物種的基因組定點(diǎn)編輯研究中[25]，不論是鋅指蛋白核酸酶或TALEN技術(shù)，還是近幾年的研究熱點(diǎn)CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，其介導(dǎo)的基因定點(diǎn)突變的原理都是在基因組中定點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，隨后誘發(fā)機(jī)體啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制從而造成DNA序列的改變。在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，RNA對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子常被用于驅(qū)動(dòng)sgRNA的轉(zhuǎn)錄，是CRISPR-Cas9系統(tǒng)中重要的元件。RNA由RNA聚合酶Ⅲ識(shí)別啟動(dòng)子來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄活性較高并且具有非常明確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)[26-28]。利用植物內(nèi)源的啟動(dòng)子，已在多種植物中建立了CRISPR-Cas9系統(tǒng)，如JACOBS等[29]運(yùn)用大豆內(nèi)源啟動(dòng)子成功修飾了大豆內(nèi)源的9個(gè)基因，在大豆中建立了CRISPR-Cas9體系；XING[15]、LI[16]等運(yùn)用擬南芥啟動(dòng)子成功實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源基因的編輯，在擬南芥中建立了CRISPR/ Cas9 基因編輯技術(shù)體系。雖然BROOKS等[30]在番茄中利用擬南芥啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA，成功實(shí)現(xiàn)了內(nèi)多位點(diǎn)的編輯，建立了番茄的CRISPR/Cas9基因編輯體系。但利用番茄內(nèi)源啟動(dòng)子的CRISPR/ Cas9系統(tǒng)是否也能實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因的編輯，目前并不清楚。另外近兩年研究表明利用多個(gè)或啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)多個(gè)sgRNA同時(shí)靶定在同一條染色體上，可造成染色體大片段的缺失而引起成簇基因的刪除。ZHANG等[31]用不同的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄6個(gè)sgRNA，在擬南芥中同時(shí)敲除了ABA的受體PYLs家族中的多個(gè)成員；ZHOU等[32]在水稻中的研究結(jié)果表明，靶位點(diǎn)除了發(fā)生小片段的堿基突變外，也檢測(cè)到染色體發(fā)生了115—245 kb不同長(zhǎng)度的大片段缺失。因此鑒定更多有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，對(duì)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用也具有重要價(jià)值。

M：2 kb plusⅡDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量2 kb plusII DNA Marker；A、B：采用RE/PCR的方法檢測(cè)MLO靶位點(diǎn)突變體檢測(cè)。空白對(duì)照為不帶有sgRNA的CRISPR-Cas9基因編輯載體；A為MLO1內(nèi)MfeⅠ靶位點(diǎn)突變的檢測(cè)。1和2分別為空白對(duì)照轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后DNA直接PCR和MfeⅠ酶切后PCR產(chǎn)物；3和4分別為：帶有MLO1-MfeⅠsgRNA的CRISPR-Cas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后DNA直接PCR和MfeⅠ酶切后PCR產(chǎn)物；B為MLO1基因內(nèi)PstⅠ靶位點(diǎn)突變的檢測(cè)。1和2分別為空白對(duì)照轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后DNA直接PCR和PstⅠ酶切后PCR產(chǎn)物；3和4分別為：帶有MLO1-PstⅠsgRNA的CRISPR-Cas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后DNA直接PCR和PstⅠ酶切后PCR產(chǎn)物；C：番茄MLO1內(nèi)兩個(gè)不同靶位點(diǎn)（PstⅠ和MfeⅠ）測(cè)序的結(jié)果。上圖是靶位點(diǎn)序列比對(duì)；下圖是靶位點(diǎn)序列測(cè)序峰圖，紅色方框?yàn)閮?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。D：MLO1內(nèi)MfeⅠ靶位點(diǎn)突變頻率分布結(jié)果圖，紅色方框?yàn)楹行蛄械耐蛔兾稽c(diǎn)A, B: Detection of mutation in MLO1 by RE/PCR assays; The negative control is CRISPR-Cas9 system without sgRNA. A: Detection of mutation in MfeⅠtarget site of MLO1 gene. Lanes 1 and 2 represent PCR products from MfeⅠ-undigested and digested negative control genomic DNA, respectively; Lanes 3 and 4 represent respectively PCR products from MfeⅠ-undigested and digested sample genomic DNA that was prepared from protoplast transformed by CRISPR-Cas9 system with MLO1-MfeⅠsgRNA; B: Detection of mutation in PstⅠtarget site of MLO1 gene. Lanes 1 and 2 represent PCR products from PstⅠ-undigested and digested negative control genomic DNA, respectively; Lanes 3 and 4 represent respectively PCR products from PstⅠ-undigested and digested sample genomic DNA that was prepared from protoplast transformed by CRISPR-Cas9 system with MLO1- PstⅠsgRNA; C: Sequencing of two target sites (PstⅠand MfeⅠ) in tomato MLO. Sequence alignment of target sites is above the picture; Sequencing peaks figure of target site is below. The red box indicates that the region recognized by restriction enzyme; D: Mutation efficiency of MLO1 in MfeⅠtarget site, respectively. The red squared indicates mutation sites contains target sequence

本研究從‘中蔬四號(hào)’番茄中克隆的4個(gè)番茄啟動(dòng)子啟動(dòng)區(qū)都含有兩個(gè)序列保守的啟動(dòng)元件TATA框和USE元件，并且這兩個(gè)元件之間的距離也比較固定，雖然間隔區(qū)的序列并不重要，但其距離大小對(duì)幫助幾何對(duì)稱的RNA聚合酶結(jié)合到一定位點(diǎn)是很重要的。依據(jù)啟動(dòng)元件的位置，本研究分別對(duì)4個(gè)啟動(dòng)子進(jìn)行兩種長(zhǎng)度的截短，共得到8個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子，與報(bào)告基因融合后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明這4種番茄啟動(dòng)子均具有轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)這4種啟動(dòng)子截短到200 bp左右時(shí)，依然能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)。這顯示出番茄的啟動(dòng)子相對(duì)較短時(shí)也具有轉(zhuǎn)錄活性，與在其他作物中克隆的啟動(dòng)子特點(diǎn)相同[33]。棉花的啟動(dòng)子截短為105 bp時(shí)，其轉(zhuǎn)錄活性并沒有降低[34]。NEKRASOV等[35]在基因組編輯技術(shù)研究中甚至使用了擬南芥79 bp長(zhǎng)度的啟動(dòng)子，并且成功實(shí)現(xiàn)了基因編輯。這些結(jié)果暗示了番茄的啟動(dòng)子可以克隆的更短。但是否可以僅保留啟動(dòng)子-60 bp位置的USE元件和-30 bp位置的TATA框還能具有轉(zhuǎn)錄活性，這需要進(jìn)一步研究。

雖然已報(bào)道許多不同物種的啟動(dòng)子在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中成功得到了應(yīng)用，但同樣的啟動(dòng)在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)物種中不一定適用，并且目前適用于番茄CRISPR-Cas9系統(tǒng)的內(nèi)源啟動(dòng)子并無報(bào)道，篩選出在番茄中有功能活性的啟動(dòng)子很有必要。本研究結(jié)果表明番茄內(nèi)源-2P4啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)了CRISPR-Cas9介導(dǎo)的番茄基因組靶向編輯?？寺y(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶位點(diǎn)的突變多為堿基的替換，這與棉花原生質(zhì)體中的基因編輯結(jié)果類似。CHEN等[5]設(shè)計(jì)了兩個(gè)sgRNA，在棉花原生質(zhì)體中成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)和位點(diǎn)內(nèi)的靶向修飾，其結(jié)果在原生質(zhì)體中也多為堿基的替換，而在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的棉花植株中卻出現(xiàn)較多的堿基缺失和插入。原因可能與原生質(zhì)體自身的細(xì)胞狀態(tài)和所處的環(huán)境有關(guān)，這與活體組織中的細(xì)胞所處的狀態(tài)和環(huán)境是不同的，可能在原生質(zhì)體細(xì)胞中同源修復(fù)機(jī)制的活性被大大激活。另一個(gè)可能的原因是原生質(zhì)體中Cas9和sgRNA是瞬時(shí)表達(dá)，靶位點(diǎn)產(chǎn)生的堿基替換突變，由于沒有足夠多的Cas9和sgRNA而不能繼續(xù)被編輯修飾。而在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植株中Cas9和sgRNA可以持續(xù)表達(dá)，靶位點(diǎn)產(chǎn)生的堿基替換突變可以被繼續(xù)編輯，直到產(chǎn)生的突變不能被sgRNA有效地識(shí)別而終止。在研究中同時(shí)也構(gòu)建了以為靶序列的CRISPR/Cas9基因編輯載體，但瞬時(shí)轉(zhuǎn)化番茄原生質(zhì)體后并沒有檢測(cè)到靶基因被編輯的現(xiàn)象，這與在線蟲中的一些研究結(jié)果相同[36]，目前原因并不清楚。單堿基的改變是否是因?yàn)镻CR擴(kuò)增過程中堿基隨機(jī)配對(duì)錯(cuò)誤產(chǎn)生的突變？為排除這個(gè)可能性，對(duì)樣品基因組DNA酶切前擴(kuò)增的PCR片段序列進(jìn)行了克隆，經(jīng)測(cè)序分析，結(jié)果顯示靶位點(diǎn)堿基的突變頻率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其兩側(cè)其他位點(diǎn)的突變頻率，表明靶序列區(qū)堿基的突變確實(shí)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向編輯的結(jié)果。

4 結(jié)論

從‘中蔬四號(hào)’番茄品種中克隆了4種8個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子，其長(zhǎng)度分別為452、202、448、206、433、190、448和218 bp，這8個(gè)啟動(dòng)子在番茄葉片中都具有轉(zhuǎn)錄活性。其中以-2P4為啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA，以白粉病相關(guān)基因?yàn)榘行蛄械腃RISPR/Cas9基因編輯載體成功地實(shí)現(xiàn)對(duì)番茄內(nèi)源基因的編輯。

[1] Sato S, Tabata S, Hirakawa H, Asamizu E, Shirasawa K, Isobe S, Kaneko T, Egholm M. The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution., 2012, 485(7400): 635-641.

[2] Hisamatsu S, Sakaue M, Takizawa A, Kato T, Kamoshita M, Ito J, Kashiwazaki N.Knockout of targeted gene in porcine somatic cells using zinc-finger nuclease., 2015, 86(2): 132-137.

[3] Sun N, Zhao H. Transcription activator-like effector nucleases (TALENs): A highly efficient and versatile tool for genome editing., 2013, 110(7): 1811-1821.

[4] Chen K, Gao C. Targeted genome modification technologies and their applications in crop improvements., 2014, 33(4): 575-583.

[5] Chen X, Lu X, Shu N, Wang S, Wang J, Wang D, Guo L, Ye W. Targeted mutagenesis in cotton (L.) using the CRISPR/Cas9 system., 2017, 7: 44304.

[6] Li C, Unver T, Zhang B. A high-efficiency CRISPR/Cas9 system for targeted mutagenesis In Cotton (L.)., 2017, 7: 43902.

[7] Liu X, Xie C, Si H, Yang J. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in plants.,2017, 3: 9.

[8] Friedland A E, Tzur Y B, Esvelt K M, Colaiácovo M P, Church G M, Calarco J A. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system., 2013, 10(8): 741-743.

[9] Wang M B, Helliwell C A, Wu L M, Waterhouse P M, Peacock W J, Dennis E S.Hairpin RNAs derived from RNA polymerase II and polymerase III promoter-directed transgenes are processed differently in plants., 2008, 14(5): 903-913.

[10] Domitrovich A M, Kunkel G R. Multiple, dispersed human U6 small nuclear RNA genes with varied transcriptional efficiencies., 2003, 31(9): 2344-2352.

[11] Jia H, Wang N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA., 2014, 9(4): e93806.

[12] 雷建峰, 伍娟, 陳曉俊, 於添平, 倪志勇, 李月, 張巨松, 劉曉東.棉花花粉中高效轉(zhuǎn)錄U6啟動(dòng)子的克隆及功能分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(19): 3794-3802.

Lei J F, Wu J, Chen X J, Yu T P, Ni Z Y, Li Y, Zhang J S, Liu X D. Cloning and functional analysis of cotton U6 promoter with high transcription activity in cotton pollen.2015, 48(19):3794-3802. (in Chinese)

[13] Simmen K A, Mattaj I W. Complex requirements for RNA polymerase III transcription of the Xenopus U6 promoter., 1990, 18(19): 5649-5657.

[14] 劉玟杉. 基于CRISPR/Cas9的擬南芥多基因編輯及其在基因功能研究中的應(yīng)用[D]重慶: 重慶大學(xué), 2015.

Liu W S. CRISPR-Cas9-mediated multiplex genome editing inand the application in gene functions study [D]. Chongqing: Chongqing University, 2015. (in Chinese)

[15] Xing H L, Dong L, Wang Z P, Zhang H Y, Han C Y, Liu B, Wang X C, Chen Q J. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants., 2014, 14(1): 327.

[16] Li J F, Norville J E, Aach J, McCormack M, Zhang D, Bush J, Church G M, Sheen J. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing inandusing guide RNA and Cas9., 2013, 31(8): 688-691.

[17] Erijman A, Shifman J M, Peleg Y. A single-tube assembly of DNA using the transfer-PCR (TPCR) platform., 2014, 1116: 89-101.

[18] Yoo S D, Cho Y H, Sheen J.mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis., 2007, 2(7): 1565-1572.

[19] Lu Y M, Chen X, Wu Y X, Wang Y P, He Y Q, Wu Y. Directly transforming PCR-amplified DNA fragments into plant cells is a versatile system that facilitates the transient expression assay., 2013, 8(2): e57171.

[20] Janga M R, Campbell L M, Rathore K S. CRISPR/Cas9- mediated targeted mutagenesis in upland cotton (L.)., 2017, 94: 349-360.

[21] Liang Z, Zhang K, Chen K, Gao C. Targeted mutagenesis inusing TALENs and the CRISPR/Cas system., 2014, 41(2): 63-68.

[22] Shan Q, Wang Y, Li J, Gao C. Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system., 2014, 9(10): 2395-2410.

[23] Jiang W, Zhou H, Bi H, Fromm M, Yang B. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in，tobacco，sorghum and rice., 2013, 41(20): e188.

[24] Jacobs T B，LaFayette P R，Schmitz R J，Parrott W A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9., 2015, 15(1): 16.

[25] Cao H X, Wang W, Le H T T, Vu G T H. The Power of CRISPR-Cas9-Induced Genome Editing to Speed Up Plant Breeding., 2016.

[26] Cong L, Ran F A, Cox D, Lin S, Barretto R, Habi b, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems., 2013, 339(6121): 819-823.

[27] Mali P, Yang L, Esvelt K M, Aach J, Guell M, DiCarlo J E, Church G M. RNA-guided human genome engineering via Cas9., 2013, 339(6121): 823-826.

[28] Belhaj K, Chaparro-Garcia A, Kamoun S, Nekrasov V. Plant genome editing made easy: Targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system., 2013, 9(1): 39.

[29] Jacobs T B, LaFayette P R, Schmitz R J, Parrott W A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9., 2015, 15(1): 16.

[30] Brooks C, Nekrasov V, Lippman Z B, Van Eck J. Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated9 System ., 2014, 166(3): 1292-1297.

[31] Zhang Z, Mao Y, Ha S, Liu W, Botella J R, Zhu J K. A multiplex CRISPR/Cas9 platform for fast and efficient editing of multiple genes in, 2016, 35(7): 1519-1533.

[32] Zhou H, Liu B, Weeks D P, Spalding M H, Yang B. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice., 2014, 42(17): 10903.

[33] Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria., 2012, 109(39): 2579-2586.

[34] 雷建峰, 李月, 徐新霞, 阿爾祖古麗·塔什, 蒲艷, 張巨松, 劉曉東. 棉花不同啟動(dòng)子截短克隆及功能鑒定. 作物學(xué)報(bào), 2016, 42(5): 675-683.

Lei J F, Li Y, Xu X X, Tashi A, Pu Y, Zhang J S, Liu X D. Cloning and functional analysis of different truncated GbU6 promoters in cotton.,2016, 42(5): 675-683.(in Chinese)

[35] Belhaj K, Chaparro-Garcia A, Kamoun S, Nekrasov V. Plant genome editing made easy: Targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system., 2013, 9(1): 39.

[36] Farboud B, Meyer B J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design., 2015, 199(4): 959-971.

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

DifferentPromoters Cloning and Establishment of CRISPR/Cas9 Mediated Gene Editing System in Tomato

PU Yan, LIU Chao, LI Ji-Yang, AERZU GULI·TaShi, HU Yan, LIU XiaoDong

(College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University/Laboratory of Agricultural Biotechnology of Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052)

【Objective】promoter is a vital element for the transcription of sgRNA inthe CRISPR/Cas9 system. It is necessary to clone some endogenouspromoters with high transcription activity and construct CRISPR/Cas9 vector, which could provide a strong technical basis for functional genomics and molecular breeding in tomato. 【Method】 Four different tomatopromoters were cloned by first round of PCR amplification from tomato cultivar Zhongshu 4. Each U6 promoter with two different length was truncated and used to construct plant expression vector carried SlU6 promoter, respectively. The Eightfusion expression vectors were transformed into tomato leaves by agroinfiltration. According to the degree ofstaining, the promoter with high transcription activity was selected to construct the CRISPR/Cas9 gene editing vector with target sequence from powdery mildew-related geneandThese gene editing vectors were transformed into tomato protoplast by PEG method. The mutation of endogenous target genes in each transformed tomato protoplast was analyzed by a restriction enzyme PCR (RE-PCR) assay. Finally, the types of endogenous gene mutation were analyzed by sequencing. The efficiency of the CRISPR/Cas9 system based on tomato endogenous U6 promoter was verified by the frequency distribution map of mutant loci. 【Result】4 kinds and 8 different lengths of tomatopromoters were obtained by two rounds of PCR. Their length was 452, 202, 448, 206, 433, 190, 448 and 218 bp, respectively. After sequences analysis, results showed that the four tomatopromoters also contained the USE motif and TATA box which were found inpromoters. The construction offusion expression vectors driven by corresponding truncated tomatopromoters were done and transformed into tomato leaves. Thehistochemical staining showed that the transformed tomato leaves were dyed blue, which indicated that all 8promoters have transcription activity. The6-2P4 promoter was chose to drive sgRNA transcription and construct the CRISPR/Cas9 system with target sequence fromandrespectively. The result showed that endogenous6-2P4 promoter could drive sgRNA transcription and genewas edited successfully in tomato. Sequence analysis revealed that all types of gene mutations are base substitution and the hotspot of mutation only exists in the target region of endogenous gene. 【Conclusion】4 kinds of6 promoters with high transcription efficiency were obtained from tomato. The established CRISPR/Cas9 system based on SlU6-2 promoter could successfully achieve the editing of endogenous genes in tomato.

CRISPR/Cas9;6 promoter; clone; tomato; gene editing

2017-06-21；

2017-07-08

國(guó)家自然科學(xué)基金（31560534）

蒲艷，E-mail：603314289@qq.com。

劉曉東，Tel：18290812916；E-mail：xiaodongliu75@aliyun.com