家蠶安全轉基因技術研究現狀與展望

龍定沛，郝占章，向仲懷，趙愛春

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家蠶安全轉基因技術研究現狀與展望

龍定沛，郝占章，向仲懷，趙愛春

（西南大學蠶學與系統生物學研究所/家蠶基因組生物學國家重點實驗室/農業部蠶桑生物學與遺傳育種重點實驗室， 重慶 400716）

轉基因技術是實現基因功能研究和生物遺傳改良的重要工具。轉基因生物安全問題主要包括轉基因操作技術安全與轉基因產品安全這兩個方面。近年來業內對轉基因生物的安全性研究主要集中于轉基因農作物、水生動物和家禽、家畜等大型動物在醫藥、農業和食品工業等領域的安全評估，而對于具有重要科研與經濟價值的農業昆蟲安全轉基因技術研究的報道則較為有限，而且農業部至今未有轉基因昆蟲安全性評估的先例。家蠶（）是重要的鱗翅目模式昆蟲和農業經濟昆蟲，家蠶安全轉基因技術的深入研究對于促進基礎遺傳學發展和推動蠶絲產業發展均具有重要價值和意義。自2000年第一例轉基因家蠶建立以來，轉基因技術已廣泛應用于家蠶基因功能鑒定的基礎研究和品種改良的應用研究領域，但轉基因家蠶的安全性問題卻成了限制轉基因家蠶實用化應用的主要瓶頸。因此，開展家蠶安全轉基因技術體系研究對促進轉基因家蠶安全性評估和產業化具有重要意義。本文系統地概述了基于條件基因打靶的家蠶安全轉基因技術體系的建立與研究現狀，討論了家蠶安全轉基因技術的發展趨勢和應用前景，以期為轉基因動物特別是農業轉基因昆蟲的安全轉基因技術建立和完善提供參考。

家蠶；生物安全；安全轉基因技術；位點特異性重組；標記基因刪除；基因定點修飾

轉基因技術是進行基因功能研究和生物遺傳改良的重要工具。自20世紀70年代初被建立以來，經過近半個世紀的發展，轉基因技術已經日臻成熟，并于近年來在功能基因組研究、定向遺傳育種、建立人類疾病模型和生物反應器開發等方面發揮了巨大作用。自轉基因技術自誕生之日起，科學界和社會公眾對轉基因生物（genetically modified organisms，GMOs）安全性的關注一直存在。近年來，隨著以大豆、玉米、棉花和油菜為代表的全球轉基因作物商業化種植面積的逐年擴大[1]，以及美國食品藥品管理局（FDA）確認水優三文魚（商品名：）成為首個可以依法商業銷售和食用的轉基因動物[2]，標志著轉基因生物產業已成為全球新的經濟增長點和增強農業國際競爭力的重要保障。

目前，人們對轉基因生物安全問題的考慮主要包括轉基因操作技術安全問題與轉基因產品（genetically modified products，GMPs）安全問題這兩個方面（中國將“轉基因植物種植和轉基因動物養殖環境安全評估”單獨列為農業部轉基因動植物申報的三大安全性評估內容之一，本文將其歸為轉基因操作技術安全范疇）。轉基因操作技術安全問題主要體現在轉入的外源基因是否會對受體動植物生長產生不良影響以及是否會對生態環境造成破壞（包括轉基因植物種植和轉基因動物養殖環境安全評估問題）。轉基因產品安全問題則主要體現在轉基因食品（主要指農作物）以及利用轉基因生物反應器生產的抗體、疫苗等醫藥制品或經其他基因工程下游技術生產的生物類制品是否會對人類健康造成潛在危害。因此，利用并結合不同的遺傳操作手段，消除轉基因生物中潛在的安全隱患，是轉基因生物新品種培育、推廣和產業化開發應用中必須解決的關鍵問題。近年來科學技術界對轉基因生物的安全性研究，主要集中于轉基因植物特別是轉基因農作物和轉基因魚類、貝類等水生動物以及轉基因家禽、家畜等大型動物在食品、醫藥和農業等領域的安全評估研究[3-8]，而對于具有重要科研與經濟價值的農業昆蟲安全轉基因技術研究的報道則較為有限。

家蠶（）是重要的鱗翅目模式昆蟲，同時也是人工飼養和迄今唯一被完全馴化的農業經濟昆蟲。利用家蠶生產絲蛋白已有超過5 000年歷史，蠶絲構成了絲綢產業的基礎，與此相關的產業還包括桑苗繁育業、蠶種制造業、養蠶業，以及食品、醫藥和生物材料等生物技術產業。蠶絲業作為中國的傳統優勢產業，為中華文明的歷史文化傳播和經濟發展作出了卓越貢獻。此外，由于家蠶具有生長周期短、遺傳背景清楚、遺傳資源豐富、絲蛋白合成、分泌及加工能力強等優點，其遺傳學研究曾與著名實驗昆蟲果蠅并駕齊驅，對經典遺傳學的發展作出了重要貢獻。自2000年第一例利用轉座子實現建立轉基因家蠶的報道以來[9]，轉基因技術已經被廣泛應用于家蠶基因功能鑒定、生物反應器開發和創制具有特定基因差異的家蠶材料。同其他轉基因生物一樣，轉基因家蠶的安全性也引起了蠶學研究者的廣泛關注。本文將介紹基于條件基因打靶技術的家蠶安全轉基因技術體系的建立與研究現狀，并對家蠶安全轉基因技術的發展趨勢和應用前景進行討論，旨在為轉基因動物特別是農業轉基因昆蟲的安全轉基因技術建立和完善提供參考。

1 基于條件基因打靶的家蠶安全轉基因體系建立

近年來，隨著轉基因技術逐漸廣泛應用于家蠶基因功能鑒定的基礎研究和品種改良的應用研究領域，越來越多的研究人員意識到，轉基因家蠶的生物安全問題是轉基因家蠶新品種推廣應用過程中不容忽視的關鍵問題。

目前創制轉基因家蠶的主要方法仍舊是基于轉座子（主要是轉座子）介導外源基因在基因組隨機整合的家蠶種系轉化技術。家蠶作為非食用性的經濟昆蟲，其轉基因安全問題主要體現在轉基因操作技術安全方面，例如轉座子在家蠶基因組的隨機整合[10]、家蠶內源或外源基因在轉基因個體中的過量[11]或異位表達[12]均可能帶來轉基因家蠶自身的生存問題。此外，尚不能完全排除轉基因家蠶攜帶的外源基因可能經由垂直漂移（vertical gene flow）所帶來的生態環境安全隱患。

為解決上述潛在轉基因家蠶生物安全問題，一方面要求管理人員加強對已獲得轉基因家蠶的生長發育、繁殖、遺傳以及各種生物性狀的監測和評估，并建立嚴格和完善的針對轉基因家蠶的管理制度和措施；另一方面則要求研究人員對現有的家蠶轉基因技術進行整合和改進，力爭從根本上解決轉基因操作技術手段所引起的轉基因家蠶潛在生物安全隱患。近年來，國內外的研究者相繼開展了利用家蠶條件基因打靶技術來解決轉基因家蠶安全隱患問題的研究。特別是自2007年以來，本研究小組系統地開展了建立基于條件基因打靶技術的家蠶安全轉基因體系的研究工作，通過利用不同種類的位點特異性重組（site-specific recombination）系統并將其與復合型轉座載體系統相結合，在一定程度上有效地解決了家蠶轉基因研究中的潛在生物安全隱患問題。

1.1 克服轉座子隨機整合引起的家蠶轉基因安全隱患

針對由轉座子隨機整合導致目標基因表達變化（異位、上調或下調表達），進而引起非預期負面效應的轉基因家蠶的問題，目前主要可利用組織特異型啟動子[11,13-15]、熱激或病菌誘導型啟動子[16-17]、藥物誘導表達系統[18-20]和GAL4/UAS雙元誘導表達系統[21]等來實現調控內源或外源目標基因在轉基因家蠶不同發育時期和不同組織中的時空特異性表達，從而達到在一定程度上克服目標基因表達變化對轉基因個體生長發育帶來的不良影響。但是，上述策略并沒有從根本上解決轉座子介導目標基因隨機整合所帶來的轉基因家蠶存活率低的問題。

自2006年以來，來源于鏈霉菌噬菌體phiC31（phiC31）的phiC31/系統先后被證實具有在家蠶細胞[22]、胚胎[23]以及個體[24]中介導發生位點特異性整合反應的活性。2013年，Long等[25]建立了一種基于phiC31/系統的重組酶介導盒式交換（phiC31-RMCE）反應的策略，用于實現外源基因在轉基因家蠶基因組預先確定染色體位點（靶位點）的精確定點整合/替換（圖1）：首先建立基因組中含有純合接納位點（/）的轉基因靶品系（transgenic target strain，TTS）家蠶，隨后將phiC31整合酶（pSLA3-Int或mRNA）與供體質粒（pSL{-3×P3-EGFP-SV40-}）共同導入TTS家蠶受精卵，從而實現phiC31整合酶介導整個供體質粒或目標基因表達框（3×P3-EGFP表達框）序列，經/位點對間的單次重組反應（即僅發生步驟1的單次交換）或2次重組反應（即同時發生步驟1和2的RMCE）定點整合至位點特異性整合品系（site-specific integration strain，SSIS）家蠶基因組。值得注意的是，經步驟1的單次交換反應整合進入SSIS家蠶基因組的供體質粒，還可進一步通過步驟2的單次交換反應，實現除3×P3-EGFP表達框序列之外載體骨架序列的完全刪除（圖1）。此外，phiC31/系統所特有的單向不可逆的整合特性，確保了定點整合的外源目標基因在SSIS家蠶后代基因組中的穩定遺傳和表達[25]。由此可見，利用phiC31-RMCE反應的策略不但能夠克服轉座子隨機整合可能引起的非預期負面效應對轉基因家蠶生長發育帶來的不良影響，而且還有助于在一定程度上消除轉座子隨機整合位置效應和插入突變以及非目標基因序列對目的基因表達及基因功能研究的影響。

1.2 克服篩選標記基因保留帶來的家蠶轉基因安全隱患

為了實現對陽性轉基因家蠶的快速篩選鑒定，研究人員往往在轉基因個體基因組中引入并保留、和neo等篩選標記基因。然而眾所周知，篩選標記基因在宿主基因組的保留，可能會增加轉基因逃逸現象的發生概率并對目標外源基因的表達產生影響，進而帶來可能的安全隱患。因此，篩選標記基因的安全問題是包括家蠶在內的幾乎所有轉基因動植物在實際推廣應用過程中必須要解決的關鍵問題之一。

位點特異性重組法是目前轉基因動植物中應用最為廣泛和有效的實現篩選標記基因刪除的方法，其在實驗設計上具有普遍性：用兩個同向排列的重組酶識別位點（、P、或等）錨定篩選標記基因，隨后通過有性雜交、溫度或化學處理等條件誘導、二次轉化等方法，在宿主個體或細胞中引入位點特異性重組酶（FLP、Cre或phiC31等）的表達來介導識別位點間的重組反應，進而實現選擇標記基因的刪除。2012年，Long等[26]率先建立了一種基于釀酒酵母（）來源的FLP/系統的策略，用于實現家蠶個體基因組水平篩選標記基因的定點刪除（圖2）：首先建立基因組中含有被位點錨定篩選標記基因（3×P3-EGFP表達框）的G1代轉基因靶品系（TTS）家蠶，隨后通過顯微注射方式在G2代TTS家蠶受精卵中引入FLP重組酶表達（pSLA3-FLP），結果將實現篩選標記基因序列在G3代位點特異性重組品系（site-specific recombination strain，SSRS）家蠶基因組的定點刪除。

圖1 經由phiC31-RMCE反應實現外源基因在轉基因家蠶基因組定點整合策略

圖2 FLP重組酶介導的轉基因家蠶篩選標記基因定點刪除策略

2016年，Long等[27]進一步證實胚胎顯微注射FLP重組酶mRNA和雜交引入FLP重組酶持續表達的方式，均能夠有效提高位點錨定的篩選標記基因在轉基因家蠶基因組的定點刪除效率。此外，還構建了由黑腹果蠅（）基因啟動子調控FLP重組酶表達的轉基因表達輔助品系家蠶，通過有性雜交結合42℃熱激處理（heat shock treatment，HST）方式在雙轉基因家蠶后代中實現了篩選標記基因的可誘導性定點刪除。

日本研究人員K?moto等[28]同樣利用FLP/系統，通過將含有hsp70-FLP表達框的FLP重組酶表達系家蠶和含有OpIE2-FRT-GFP-FRT- DsRed表達框的轉基因報告品系家蠶進行有性雜交結合熱激處理的方式，實現了被位點錨定的標記基因表達框在雜交F1代雙轉基因家蠶體細胞中的定點刪除，以及下游基因的表達激活。

1.3 實現外源基因穩定整合、表達以及精確替換的家蠶安全轉基因策略

外源目標基因在宿主基因組的不穩定整合現象，是轉基因生物最主要的潛在安全隱患之一。轉座子在宿主基因組中再轉座所引起的外源基因不穩定整合現象，可能會帶來諸如外源基因表達不穩定、轉基因丟失和逃逸等問題。目前在包括小鼠[29]、果蠅[30]、家蠶[31]等動物中均觀察到了轉座子在宿主細胞基因組中的再轉座現象。張雨麗等[32]在廣西大面積試點飼養含有單拷貝外源基因插入的轉基因家蠶品種“西綠”的過程中，曾觀察到外源基因在傳代培養和雜交選育過程中丟失的現象。引起轉基因丟失現象的關鍵原因可能在于宿主細胞中含有非預期的具有轉座酶活性的蛋白，這些蛋白可能是由宿主基因組中存在的未經鑒定的內源轉座酶基因所編碼，也可能是通過水平基因轉移進入宿主基因組的外源轉座酶基因所編碼[10]。家蠶是人工馴化的昆蟲，其生存與繁殖完全依賴于人工飼養[33]，因此家蠶通過水平基因轉移獲得具有轉座酶活性的外源蛋白的可能性相對較小。早期研究證實，家蠶基因組中至少存在100條-like轉座子序列（BmPBLE1-98、yabusame-1和yabusame-W）[34-35]，這些序列編碼產生的具有潛在轉座酶活性的內源蛋白在家蠶體內是否具有功能需要進一步研究。

根據的轉座原理，理論上只要刪除轉座子臂單側或兩側的末端反向重復序列（ITR），就可實現轉座子在宿主基因組的穩定整合[36]。2015年，Long等[37]聯合phiC31/系統和改造的復合型轉座載體系統，開發了一項通用且有效的實現外源目標基因在家蠶基因組穩定整合、表達以及精確替換的策略（圖3）：利用復合型轉座載體（PB-TP），建立基因組中含有完整的4個轉座子臂序列（L1、R1、L2和R2）插入的轉基因家蠶（TS1-RgG）；通過熱激誘導轉座酶（PBase）在轉基因家蠶（TS2-RgG）體內表達，從而使得目標基因表達框（Fib-H-EGFP-LBS）單側或兩側的轉座子（R1–L2和/或R2–L1）經再轉座而刪除，最終獲得單側（TS3-Rg和TS3-gG）或兩側轉座子（TS3-g和TS4-g）刪除的后代轉基因家蠶。

利用上述策略可實現包括轉座子臂和篩選標記基因在內的所有目標基因以外載體骨架序列的完全消除，從而確保了目標基因在家蠶基因組的穩定整合。此外，通過phiC31-RMCE反應可實現將由啟動子或者其他絲腺特異型啟動子（如--啟動子和啟動子），甚至其他類型組織特異型啟動子（如脂肪體和中腸組織特異型啟動子）調控的不同外源蛋白基因，精確地整合進入與TS3-g2家蠶的FibH-EGFP表達框相同的基因組位點，從而創制出外源蛋白表達更為優化的家蠶生物反應器[37]。

值得注意的是，Long等[37]還以上述研究為基礎，進一步描述了一種聯合復合型轉座載體、phiC31-RMCE系統以及FLP/系統的家蠶安全轉基因策略，用于實現對預先插入家蠶基因組的外源基因的定點修飾（圖4）：首先利用復合型轉座載體建立基因組中僅含有被位點錨定目標基因表達框（Target 1）的轉基因家蠶系；隨后通過phiC31-RMCE反應介導攜帶其他目標基因表達框（Target 2）以及被位點錨定的篩選標記基因表達框（Marker 2）和FLP重組酶表達框的外源DNA序列，與基因組靶位點穩定整合的Target 1發生定點替換；最后利用誘導型啟動子（inducible promoter，IP）調控FLP重組酶表達，實現對Marker 2以及FLP重組酶表達框自身的自動定點刪除。上述策略在確保實現外源基因穩定整合于家蠶基因組靶位點的同時，有效克服了轉座子隨機整合位置效應和載體骨架序列保留對基因功能分析的影響，并可實現對不同外源基因在相同染色體插入位點功能的比較研究。最為關鍵的是，該策略對真正意義上建立安全轉基因家蠶具有重要的理論和實踐意義，該策略應用的通用性決定其同樣可適用于其他鱗翅目類轉基因昆蟲的生物安全防控研究領域。

L1、R1、L2和R2分別表示4個piggyBac轉座子臂；G1代轉基因品系（transgenic strain，TS）命名為TS1，其后代依次命名為TS2、TS3……，依次類推；含有不同熒光表型的TSn家蠶，根據其熒光表型的不同，如3×P3-DsRed（R）、FibH-EGFP（g）或3×P3-EGFP（G），分別縮寫為TSn-R、TSn-G或TSn-g（“n”代表世代），比如來自G1代的轉基因家蠶個體同時含有3種不同的熒光表型，則記為“TS1-RgG”

2 家蠶安全轉基因技術的發展趨勢及應用前景

2.1 不同位點特異性重組系統的聯合應用

FLP/、Cre/和phiC31/系統作為目前應用最為廣泛的3種位點特異性重組系統，均已經被證實能夠應用于家蠶個體基因組水平的遺傳操作，而且不同類型系統介導的位點特異性重組形式（整合或刪除）具有偏好性[25-26,38]。因此，基于位點特異性重組系統的家蠶條件基因打靶技術，往往需要將多種不同類型重組系統進行組合運用，才能通過對基因組的精細操作來實現安全轉基因家蠶的創制。如上文所述，Long等[37]建立的實現對預先插入家蠶基因組的外源基因進行定點修飾的家蠶安全轉基因策略，即結合了phiC31/系統更適用于通過RMCE反應介導外源目標DNA在靶位點定點整合的優點和FLP/系統更適用于介導目標DNA定點刪除的特性。

早在2005年，基于FLP/和Cre/系統的RMCE（FLP-RMCE和Cre-RMCE）反應就已經被成功應用于黑腹果蠅的轉基因研究[39-41]。2013年，Schetelig等[42]在加勒比按實蠅（）中證實了通過Cre-RMCE反應實現外源目標基因在基因組靶位點定點整合的可行性。與phiC31-RMCE相比，FLP-RMCE和Cre-RMCE的最主要優勢在于其能夠實現轉基因在單個靶位點的反復插入/刪除反應[39,42]。2015年，Haghighat-Khah等[43]聯合phiC31/和Cre/（或FLP/）系統開發了一種整合酶-重組酶介導的盒式交換（integrase-recombinase mediated cassette exchange，iRMCE）策略，并利用該策略分別在埃及伊蚊（）和小菜蛾（）中實現了基于phiC31/系統介導的外源供體質粒定點整合以及基于Cre/（或FLP/）系統介導的載體骨架序列定點刪除。 由此可見，隨著昆蟲遺傳轉化技術的不斷進步與發展，在今后的研究中，包括FLP-RMCE、Cre-RMCE以及多種不同類型位點特異性重組系統相結合的策略，均具有應用于實現更為精細的家蠶遺傳操作 的潛力，是家蠶安全轉基因技術發展的主要趨勢 之一。

Marker 1和Marker 2分別代表不同的篩選標記基因表達框；Target 1和Target 2分別代表不同的目標基因表達框；IP代表誘導型啟動子，Ter代表終止子 Marker 1 and Marker 2 indicate different marker gene expression cassettes; Target 1 and Target 2 indicate different target gene expression cassettes; IP indicates the inducible promoter, and Ter indicates the termination sequence

2.2 基因組靶向編輯技術與位點特異性重組系統的聯合應用

近年來，不同類型人工核酸內切酶（包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系統等）系統的基因組靶向編輯技術已成功應用于對家蠶內源基因的定點敲除以及外源基因的定點整合操作[44-46]。顯而易見，利用這些基因組靶向編輯技術，有望實現介導不含任意非目標序列的外源基因在家蠶基因組的定點整合，有效克服外源目標基因隨機整合和不穩定整合帶來的轉基因家蠶生物安全隱患。此外，這些基因組靶向編輯技術同樣具有實現轉基因家蠶中刪除篩選標記基因的潛力。但是，目前報道的家蠶基因組靶向編輯技術仍存在介導外源基因整合效率較低、整合外源片段大小較為有限、定點整合供體質粒同源臂構建較為困難等缺點和局限性[47-49]。

針對上述基因組靶向編輯技術在單獨應用時存在的缺點或局限性，在以后的研究中可首先利用人工核酸內切酶系統將、P、或等整合酶識別位點序列定點整合至家蠶基因組靶位點，隨后即可借助FLP、Cre或phiC31等位點特異性重組酶/整合酶介導大片段外源基因在基因組靶位點的定點整合。位點特異性重組系統與基因組靶向編輯技術聯合應用于開發更為完善的家蠶轉基因操作體系，必將有助于克服基因組靶向編輯系統單獨應用的缺點和局限性，推動家蠶安全轉基因研究和轉基因家蠶產業化推廣研究的發展。

2.3 實現對轉基因蠶種的安全控制問題

如前文所述，通過聯合復合型轉座系統與不同的位點特異性重組系統建立的安全轉基因策略，已經能夠有效克服由轉座子隨機整合引起的轉基因家蠶自身安全問題，以及由轉座子整合不穩定性和非目標基因序列保留在基因組中的問題。但是，攜帶外源基因的轉基因蠶種在實際大規模推廣應用過程中可能發生的生產和生態環境安全問題目前尚未得到有效解決。眾所周知，蠶業只用家蠶日系原種×華系原種的雜交一代（F1）蠶種進行大面積生產，蠶農在農村飼養家蠶的過程中無法施行對蠶種的嚴格管理與控制，無法防止轉基因蠶種的不可控擴散，所以轉基因家蠶目前只能在實驗室或蠶種場嚴格管理的轉基因蠶房中小規模飼養。關于轉基因蠶種的安全控制問題仍然是目前最根本和亟待解決的重要問題之一。這一問題將直接影響轉基因家蠶被批準應用和推廣的安全評估，阻礙轉基因家蠶的大規模推廣應用和產業化發展。在今后的研究中，為了防止轉基因F1蠶種在推廣應用過程中不可控的轉基因擴散安全隱患，本研究小組將在前期研究基礎上，探索聯合應用包括家蠶組織特異型啟動子（特別是生殖腺特異表達基因啟動子[50]）、GAL4/UAS二元表達系統[21]、位點特異性重組系 統[51-53]、人工核酸內切酶系統等在內的不同基因操作工具，在生殖細胞基因組中刪除外源目的基因，而在非生殖細胞基因組中保留外源目的基因，創制新型F1轉基因家蠶種。這一策略既可實現外源有益蛋白在轉基因家蠶特定組織或器官中的表達（即 目的經濟性狀的實現），又可避免轉基因在后代蠶種保留所帶來的生物安全隱患。利用上述策略， 有望從根本上解決F1轉基因蠶種的安全控制問題，推動建立較為完善的轉基因家蠶安全操作技術體系促進轉基因家蠶的產業化開發與應用，同時為其他動植物物種的安全轉基因研究發展提供重要 參考。

總而言之，隨著科學技術尤其是轉基因技術的不斷進步與發展，期望轉基因家蠶能夠在不久的將來，作為一種真正實現安全轉基因的昆蟲甚至動物范本，通過不斷消除轉基因生物的安全隱患，消除公眾對轉基因生物安全性的疑慮，推動安全轉基因技術的多元化發展及轉基因經濟動物的產業化開發，實現使轉基因技術造福于人的目標。

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（責任編輯 岳梅）

Current Status of Transgenic Technologies for Safety Consideration in Silkworm () and Future Perspectives

LONG DingPei, Hao ZhanZhang, XIANG ZhongHuai, ZHAO AiChun

(Institute of Sericulture and Systems Biology, Southwest University/State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology/Key Laboratory of Sericultural Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Chongqing 400716)

Transgenic technology is an important tool for gene function analysis and genetic improvement of biological variety.At present, the safety problems of GMOs mainly focus on the safety of genetic manipulation techniques and genetically modified products. In recent years, the researches on the safety of GMOs werefocused on evaluating the security level of genetically modified crops, aquatic animals and poultry, livestock and other large animals in medicine, agriculture, and food industry, but the reports of the safety of genetic manipulation techniquesare still rare in the agricultural insects which have important scientific and economic value, and the Ministry of Agriculture has not yet set a precedent forthe safety assessment of transgenic insects. The silkworm () is an important mode lepidopteran and economic insect for agriculture. In-depth research on the safety of transgenic technologies of, which has important value and significance for promoting the development of basic genetics and silk industry. Since the first report of the germline transformation of theusing atransposon-derived vector in 2000, transgenic technology has been widely used in the basic research of gene function identification and the applied research of creating new varieties with specific gene differences in. But the safety problems of transgenichave become the key problems that hindering the practical application of transgenic. Therefore, doing research on the safety of transgenic technologies ofis of great significance to promote the safety assessment and industrialization of transgenic. This paper summarizes the establishment and research status of the conditional gene targeting-based safety of transgenic technologies of, while the development trends and application prospect of these technologies inare also discussed, as well as provide references for establishing andperfecting the safety of transgenic technologies in other transgenic animals, especially the agriculture insect species.

silkworm(); biosafety; safe transgenic technology; site-specific recombination; marker gene deletion; target genome editing and integration

2017-03-30；

2017-05-23

國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-22-ZJ0102）、中國博士后科學基金（2015M580768，2016T90829）、重慶市基礎科學與前沿技術研究專項（cstc2016jcyjA0237）、中央高校基本科研業務費項目（XDJK2016C089）

龍定沛，Tel：023-68251903；E-mail：dplong@yeah.net。

趙愛春，Tel：023-68251803；E-mail：zhaoaichun@hotmail.com；zhaoaichun@swu.edu.cn