猴頭多糖提取鑒定及抗腫瘤作用的研究進(jìn)展

石祥生，于　濤

(東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心/東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱　150040)

目前，癌癥是危害人類健康的重大疾病之一，近年來癌癥發(fā)病率逐步增長且死亡率極高。化療是癌癥治療的重要手段之一，但多數(shù)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞缺乏特異性，在治療腫瘤的同時(shí)會(huì)損傷正常組織進(jìn)而產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用[1-2]。人體的免疫耐受及免疫抑制反應(yīng)是腫瘤發(fā)生和生長的重要原因之一，增強(qiáng)腫瘤免疫功能已經(jīng)成為一種對(duì)宿主無害的癌癥治療新策略[3]。多糖是由10個(gè)及以上單糖通過糖苷鍵結(jié)合形成的高分子碳水化合物，在自然界中分布廣泛。研究表明，多糖能通過產(chǎn)生細(xì)胞毒性及提高宿主機(jī)體免疫應(yīng)答等方式達(dá)到抗腫瘤作用[4-7]。目前，菌菇多糖由于具有顯著抗腫瘤作用在醫(yī)藥領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。

猴頭菌(Hericiumerinaceus)又名猴菇，是一種常見食用菌。猴頭菌富含多種生物活性物質(zhì)，其中多糖成分最具藥用價(jià)值。研究顯示，猴頭多糖具有治療胃潰瘍、降血壓、降血糖、降血脂、抗氧化及保護(hù)神經(jīng)的作用[8-11]。近些年，多項(xiàng)研究表明，猴頭菇中的多糖成分具有顯著的抗腫瘤活性。本文將對(duì)猴頭菇多糖的提取鑒定技術(shù)、抗腫瘤活性及其機(jī)制的研究進(jìn)行綜述和總結(jié)。

1　猴頭多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定研究

猴頭多糖的提取方法主要有熱水浸提法、稀酸稀堿提取法、酶輔助提取法、超聲及微波輔助提取法。通過上述方法提取的多糖通常含有雜質(zhì)，需進(jìn)行純化除雜。純化的主要目的是去除多余的蛋白(主要方法有Sevage法、三氯乙酸法、蛋白酶法)和小分子雜質(zhì)(主要方法有透析、超濾、反滲透法)，顏色較深的多糖提取物還需脫色(主要方法有活性炭法、大孔樹脂吸附法、過氧化氫法)。運(yùn)用色譜技術(shù)將多糖分級(jí)純化是多糖除雜后的重要過程，需通過纖維素柱色譜、離子交換層析、凝膠滲透色譜等方法將混合多糖分成若干組分。純化后的多糖還需對(duì)純度、平均分子量、單糖組分、糖苷鍵鍵型、連接方式及結(jié)構(gòu)等特征進(jìn)行測(cè)定，運(yùn)用的方法主要有高效液相色譜、甲基化分析、Smith降解、部分酸水解、氣相質(zhì)譜法、紅外光譜法、核磁共振分析等。

楊勇杰等[12]利用傳統(tǒng)的水提醇沉法從猴頭中提取得到混合多糖HEP，又利用Sephadex G150凝膠柱層析從HEP中分離得到組分HEP-2。通過有機(jī)元素分析、紅外光譜分析、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜分析(ICP-AES)等多種分析方法確定HEP-2的化學(xué)組分有多糖(62.52%)、蛋白(7.49%)、硫酸基(18.50%)和金屬離子(12.64%)，初步確定HEP-2是一種含蛋白質(zhì)和硫酸基的硫酸酯多糖。Wang等[13]用熱水提取和乙醇沉淀法從猴頭子實(shí)體中提取了水溶性的混合多糖HP，然后利用DEAE瓊脂糖凝膠和CL-6B柱色譜分級(jí)得到2個(gè)多糖組分HPA和HPB，通過甲基化和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析、紅外光譜分析、高碘酸氧化和Smith降解、部分酸水解的方法確定了兩個(gè)組分的單糖組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，兩者均含β-糖苷鍵，HPA的單糖組成為葡萄糖、半乳糖、巖藻糖，摩爾比為1∶2.110∶0.423。HPB的單糖組成為半乳糖和葡萄糖，摩爾比為1∶11.529。張金亭等[14]從小刺猴頭中提取出粗多糖，利用DEAE-Sepharose CL-6B和葡聚糖 Sephadex G-100柱色譜進(jìn)一步分離純化出多糖組分HP1，檢測(cè)其平均相對(duì)分子質(zhì)量為65 000 Da，用氣相色譜和紙色譜分析其單糖組成為巖藻糖、葡萄糖、半乳糖，摩爾比為0.423∶1∶2.110，紅外光譜結(jié)果顯示，HP1是以β-糖苷鍵為主的中性雜多糖。Zhang等[15]從猴頭子實(shí)體中分離得到一種新型的雜多糖HEPF3，HEPF3的平均相對(duì)分子質(zhì)量為 1.9×104Da，是由海藻糖和半乳糖以 1∶4.12的摩爾比組成，經(jīng)過組成成分分析、甲基化分析、1H和13C核磁共振分析確定HEPF3是由一個(gè)含戊多糖重復(fù)單元的高分子主鏈和較小比例的 3-O-甲基化鼠李糖分支組成。

2　猴頭多糖抗腫瘤活性與機(jī)制的研究

2.1　猴頭多糖體外抗癌活性及機(jī)制

猴頭多糖在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞并無抑制活性，但從猴頭深層發(fā)酵液中提取到的糖類物質(zhì)對(duì)一些種類的癌癥細(xì)胞具有生長抑制活性，主要機(jī)制是阻滯細(xì)胞周期的某階段從而抑制細(xì)胞的增值。蘇玲等[16]從小刺猴頭菌液體深層發(fā)酵浸膏中提取出兩個(gè)組分的糖類，大分子糖組分(HFP)和小分子糖組分(HFA)，之后分別對(duì)兩個(gè)糖組分進(jìn)行體外抗腫瘤試驗(yàn)，利用MTT法觀察不同濃度(15.625～2 000μg/mL)的HFP和HFA對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC7721、人肺腺癌細(xì)胞SPC-a-1、人胃癌細(xì)胞SGC7901三種腫瘤細(xì)胞系的增殖抑制活性。結(jié)果顯示，HFP和HFA對(duì)SMMC7721、SPC-a-1、SGC7901 均有增殖抑制活性，且基本呈劑量依賴關(guān)系，在藥物濃度大于250μg/mL的時(shí)候抑制率明顯；研究發(fā)現(xiàn)，HFP的作用效果好于 HFA，抑制率最高能達(dá)到70.5%。王雪等[17]從小刺猴頭的液體深層發(fā)酵浸膏中提取到多個(gè)多糖組分，利用MTT法初步篩選出在體外對(duì)Hela細(xì)胞增殖抑制率最高的組分Hep2，其機(jī)制是通過對(duì)癌細(xì)胞細(xì)胞周期的S 期和 G2/M 期進(jìn)行阻滯從而抑制其生長，并將Hep2與臨床化療藥物5-Fu聯(lián)用在體外對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行增殖抑制試驗(yàn)，證明猴頭多糖可以與化療藥物協(xié)同作用在體外抑制Hela細(xì)胞的增值。

2.2　猴頭多糖體內(nèi)抗癌活性及機(jī)制

研究表明，猴頭多糖在體內(nèi)的抗癌活性通常和免疫及細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)，其主要機(jī)制是通過對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，降低腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的水平，以及誘發(fā)細(xì)胞凋亡，而抑制腫瘤的生長。

Wang等[18]在猴頭和H.傘狀蘑菇的發(fā)酵浸膏培養(yǎng)液中提取了多糖成分，在ICR小鼠體內(nèi)進(jìn)行抗腫瘤和免疫活性研究。結(jié)果表明，兩種多糖都具有顯著的抗人造肺轉(zhuǎn)移性腫瘤的作用，相比之下，從猴頭菇中提取的多糖比從H.傘狀蘑菇中提取的多糖更有效。進(jìn)一步研究表明，多糖可以增強(qiáng)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增值，在試驗(yàn)組中CD4+細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量均顯著高于對(duì)照組。Liu等[19]研究表明，猴頭多糖和香菇多糖均對(duì)荷瘤小鼠S180肉瘤具有抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用。在Lee等[20]的實(shí)驗(yàn)研究中，從猴頭中提取的水溶性粗多糖可以通過激活巨噬細(xì)胞來上調(diào)免疫調(diào)節(jié)功能，如一氧化氮(NO)的產(chǎn)生和細(xì)胞因子(IL-1β和TNF-β)的表達(dá)。夏松柏等[21]利用小鼠建立S180肉瘤模型，以灌胃方式給予猴頭多糖并分離血清，結(jié)果顯示，給藥組均有一定的抑瘤率，通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)多糖給藥組血清中兩種細(xì)胞因子 IFN-γ和IL-2 的水平均高于對(duì)照組，表明猴頭多糖可以促進(jìn)IFN-γ和IL-2的分泌，通過提高機(jī)體的免疫機(jī)能進(jìn)而產(chǎn)生腫瘤抑制作用。具振瑤等[22]研究表明，猴頭多糖可以提高S180荷瘤小鼠血清中IFN-γ和IL-2的水平，從而增強(qiáng)免疫功能，并且降低VEGF水平。彭瀛等[23]研究表明，猴頭多糖對(duì)H22肝癌移植瘤荷瘤小鼠的腫瘤生長均有抑制作用，多糖給藥組小鼠的體重有增加趨勢(shì)，血清中細(xì)胞因子IL-2、TNF-α的水平有所提高，VEGF含量降低，其機(jī)制與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫相關(guān)功能并降低腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的生成有關(guān)。

Lee等[24]研究發(fā)現(xiàn)，協(xié)同使用猴頭多糖和阿霉素(Dox)可有效誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞的凋亡，其中多糖可以作為阿霉素(Dox)-介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)的增敏劑，并且這種增敏作用還能活化c-Jun N末端激酶(JNK)，降低c-FLIP的表達(dá)，也可以通過抑制HepG2細(xì)胞中的核因子(NF)-κB活性來增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)Dox的積累，能實(shí)現(xiàn)更好的協(xié)同抑制作用。于子雯等[25]研究表明，服用猴頭多糖能提高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，下調(diào)腫瘤細(xì)胞中抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的水平，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，從而加速腫瘤細(xì)胞的凋亡。姜穎等[26]建立小鼠S180肉瘤模型，以灌胃方式給予猴頭多糖，高中低劑量給藥組均有一定的抑瘤率，并運(yùn)用TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡情況及免疫組化法檢測(cè)肉瘤組織的 Caspase-3 蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，猴頭多糖可以提高Caspase-3 蛋白的表達(dá)水平，從而促進(jìn)肉瘤細(xì)胞的凋亡。

3　前景與展望

癌癥是目前危害人類健康的一類重大疾病，基于目前的放療、化療等常規(guī)癌癥治療方法對(duì)機(jī)體的毒副作用過大，尋找天然安全的有抗癌功效的生物活性物質(zhì)已成為研究熱點(diǎn)，菌類多糖便是其中之一。因猴頭類多糖已被多次報(bào)道有抗腫瘤活性，本文綜述了近年來國內(nèi)外關(guān)于猴頭類多糖的提取鑒定及抗癌活性的相關(guān)研究。雖然已經(jīng)證明猴頭多糖對(duì)部分腫瘤有抑制活性，且有初步的抗癌機(jī)理的探究，但仍存在一些需要解決的問題。比如目前進(jìn)行大量的多糖純化及結(jié)構(gòu)解析的研究，因?yàn)楹镱^菇種類不同，分離純化的過程和方法不同，導(dǎo)致分級(jí)結(jié)構(gòu)及表征結(jié)果均有不同，多糖抗癌活性及其分子構(gòu)效關(guān)系的闡述仍不深入，未能準(zhǔn)確判斷多糖混合物及不同的純化組分的活性機(jī)理的異同等，這些問題嚴(yán)重限制了多糖類活性物質(zhì)的開發(fā)生產(chǎn)和活性機(jī)制的研究。今后的研究方向應(yīng)考慮從細(xì)胞、分子及基因水平深入探究猴頭多糖的抗癌機(jī)制，準(zhǔn)確篩選并分析鑒定有抗癌活性的多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)，這有利于大批量工業(yè)化生產(chǎn)多糖藥物并應(yīng)用于臨床，使其為人類的抗癌事業(yè)做出巨大的貢獻(xiàn)。◇

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