過敏性鼻炎患者外周血嗜酸性粒細胞富集群中IL-18、IL-18BP和IL-18R的表達

崔夫波，柴文戍，張慧云，王君靈，胡雅琳，王 玲，何韶衡

1)錦州醫科大學附屬第一醫院變態反應與臨床免疫研究中心 遼寧錦州 121001 2)錦州醫科大學附屬第一醫院呼吸內科 遼寧錦州 121001 3)蘇州市相城人民醫院中心實驗室 江蘇蘇州 215100

據報道[1]中國大陸人口過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)的患病率為4%～38%，全球患病率為10%～25%，且20%～30%的AR患者常伴哮喘。AR作為一種常見病、多發病，影響著患者的生活質量和人類健康[2]。AR發病機制復雜，人們曾提出Th1/Th2/Th17/Treg細胞模式學說[3]，認為機體高表達Th2細胞因子，進而誘導IgE生成、增強氣道嗜酸性粒細胞浸潤和提高氣道反應性等是AR的重要原因[4]。IL-18作為炎癥因子可調節Th1/Th2平衡，廣泛參與包括鼻炎、哮喘等過敏性疾病[5-7]。研究[6,8]表明，AR患者血清IL-18水平升高。IL-18結合蛋白(IL-18 binding protein，IL-18BP)作為IL-18的天然抑制劑，可通過中和IL-18而抑制IL-18與IL-18受體(IL-18R)結合[9-10]，進而降低表達IL-18R的效應細胞(Th1、Th2和Th17等)的功能。有報道[4]稱，AR患者用過敏原鼻腔激發4～6 h后，可出現以鼻塞為主并伴有鼻黏膜內嗜酸性粒細胞浸潤和活化的遲發相反應，提示過敏原和嗜酸性粒細胞參與AR發病。本研究旨在用流式細胞儀檢測AR患者外周血經過敏原刺激前后嗜酸性粒細胞富集群中IL-18、IL-18BP和IL-18R的表達情況，希望為以后IL-18、IL-18BP和IL-18R與嗜酸性粒細胞的相關研究提供方向。

1 材料與方法

1.1實驗材料PE/Cy7-CD14抗體、PerCP-CD16抗體、死細胞去除染料、BV510-驢抗兔IgG、FcR阻斷劑、紅細胞裂解液、布雷非德菌素A(BFA)購自Biolegend公司(美國)，PE-IL-18、APC-IL-18R購自R&D Systems公司(美國)，兔抗人IL-18BP購自Abcam公司(英國)，蒿草花粉提取液、塵螨提取液和梧桐花粉提取液購自北京新華聯協和藥業有限責任公司(中國)，PBS購自Solarbio公司(美國)，Cytofix/CytopermTM固定/透膜試劑盒購自BD Biosciences Pharmigen公司(美國)，皮膚點刺試驗過敏原購自ALK-ABELLO公司(丹麥)，其他常用化學試劑均為分析純。低溫高速離心機(美國Thermo Scientific公司)，水浴鍋(中國精宏公司)，FACSVerse流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)。

1.2研究對象和樣本采集募集AR急性發作期入院患者和體檢健康者(正常對照組)為志愿者。30位志愿者的一般資料見表1。AR的診斷標準符合2015年美國耳鼻咽喉頭頸外科學會專家組發布的過敏性鼻炎臨床實踐指南[11]。AR患者均處于急性發作期，且至少2周前停止服用治療鼻炎的藥物。所有志愿者至少一個月內未發生過呼吸道感染。本研究獲得了錦州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會的批準，并與志愿者均簽訂了知情同意書。每位志愿者采集10 mL外周靜脈血于含EDTA抗凝劑的采血管中待測。

表1 30例志愿者的一般資料

年齡、病史和發病年齡均為中位數(極小值～極大值)

1.3血液嗜酸性粒細胞富集群中IL-18、IL-18BP和IL-18R的表達全血分成4份，分別加入BFA、塵螨、蒿草花粉或梧桐花粉過敏原粗提液(質量濃度為1.0 mg/L)，37 ℃水浴振蕩孵育1 h；1 400 r/min離心后棄去上清，加入死細胞去除染料與FcR阻斷劑，均勻混合后，避光孵育15 min，然后加入抗CD14、CD16和IL-18R抗體，避光孵育15 min后裂解紅細胞，離心后用固定/透膜液固定細胞，然后加入抗IL-18和抗IL-18BP抗體孵育，透膜洗液清洗后加入BV510-驢抗兔IgG，最后上流式細胞儀檢測嗜酸性粒細胞富集群中IL-18+、IL-18BP+和IL-18R+細胞比例及平均熒光強度(MFI)。

1.4統計學處理用SPSS 13.0處理數據。采用k個相關樣本的秩和檢驗分析過敏原刺激前后正常對照組或AR組以上指標的差異，采用秩和檢驗比較2組刺激前以上指標的差異，用秩相關系數分析AR組IL-18BP+細胞和IL-18+細胞MFI的關系，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組IL-18+、IL-18BP+和IL-18R+細胞比例及MFI的比較見表2、3。激發前，與正常對照組比較，AR患者嗜酸性粒細胞富集群中IL-18+細胞比例無變化，但IL-18BP+和IL-18R+細胞比例分別是正常對照組的1.879倍和1.698倍。梧桐花粉粗提液刺激后AR患者外周血IL-18+細胞比例升高約33%。正常對照組激發前后，外周血嗜酸性粒細胞富集群中IL-18+、IL-18BP+和IL-18R+細胞比例和MFI差異均無統計學意義。

表2 2組嗜酸性粒細胞富集群中IL-18+、IL-18BP+和IL-18R+細胞比例的比較 %

#: 與正常對照組激發前相比，P<0.05；*:與AR組激發前相比，P<0.05

表3 2組嗜酸性粒細胞富集群中IL-18+、IL-18BP+和IL-18R+細胞MFI的比較

2.2AR患者IL-18BP+細胞和IL-18+細胞MFI的關系AR患者嗜酸性粒細胞富集群中IL-18BP+細胞和IL-18+細胞MFI高度相關(rS=0.783，P<0.001)。

3 討論

大量的研究[12-13]認為IL-18可協同IL-12抑制Th2細胞的增殖，減少Th2細胞釋放炎癥遞質，從而抑制氣道炎癥。也有研究[5,8]表明IL-18可促進特異性IgE生成及誘導Th2細胞分泌Th2細胞因子(如IL-4、IL-5和IL-13等)，且其血液水平隨過敏性疾病炎癥程度的加重有增高的趨勢。本研究結果顯示，AR患者外周血嗜酸性粒細胞富集群中IL-18+細胞比例與正常對照組相比差異無統計學意義，然而經梧桐花粉過敏原刺激后IL-18+細胞比例升高約33%，提示梧桐花粉過敏原可能誘導了嗜酸性粒細胞釋放IL-18。

IL-18通過與細胞表面的IL-18R相互作用在機體防御及致病過程中發揮其生物學功能。哮喘兒童肺組織中嗜酸性粒細胞升高并伴有IL-18R表達增加[14]。之前的研究[7]發現OVA致敏鼠腹腔注射IL-18后可誘導小鼠腹腔灌注液中肥大細胞IL-18R表達上調。以上研究提示嗜酸性粒細胞、肥大細胞表面的IL-18R可能在過敏性疾病中起重要作用。本研究結果顯示AR患者外周血嗜酸性粒細胞富集群中IL-18R的表達約為正常對照組的1.7倍，進一步提示嗜酸性粒細胞表面的IL-18R可能在AR中起重要作用。

IL-18可與IL-18BP結合而降低IL-18BP的生物學活性，目前人們對IL-18BP的抗炎作用進行了廣泛研究[9-10,15-16]。我們的研究發現AR患者嗜酸性粒細胞富集群中IL-18BP+細胞約為正常對照組的1.8倍。有研究[10]顯示，類風濕關節炎滑膜成纖維細胞中IL-18與IL-18BP的表達高度相關。本研究結果顯示AR患者嗜酸性粒細胞群中IL-18BP+細胞MFI和IL-18+細胞MFI高度相關，提示IL-18BP可能通過正反饋機制中和IL-18進而抑制AR發病。

綜上所述，嗜酸性粒細胞源的IL-18、IL-18BP和IL-18R可能在AR中起重要作用，IL-18、IL-18BP及IL-18R可能是治療AR的潛在靶點。

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