麝香酮對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后早期MMP9蛋白表達(dá)的影響

蔣光元 羅 超 彭 形 肖 剛 滕志朋

（重慶市中醫(yī)研究院，重慶 400021）

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是一種創(chuàng)傷性疾病，是導(dǎo)致患者傷殘及死亡的主要原因［1］。TBI后會(huì)發(fā)生細(xì)胞的死亡及水腫，是繼發(fā)性腦損傷的重要原因之一，目前研究發(fā)現(xiàn)TBI后腦水腫發(fā)生與血腦屏障的破壞有著密切關(guān)系，血腦屏障的通透性改變是創(chuàng)傷性腦水腫發(fā)生的重要原因之一［2］。 基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein 9）是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中主要在腦組織中表達(dá)的一種蛋白，MMP9與腦水腫發(fā)生密切相關(guān)，它的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，加重腦水腫的發(fā)生［3］。因此，早期預(yù)防腦水腫的發(fā)生對(duì)TBI預(yù)后有著重要的臨床意義。麝香酮是中藥麝香主要成分，具有醒腦開(kāi)竅、通經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛等功效［4］，且對(duì)血腦屏障具有保護(hù)作用，但其具體的作用機(jī)制目前研究不清楚。因此，本研究探討麝香酮對(duì)TBI的保護(hù)作用及其醒腦開(kāi)竅的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 160只雄性SD大鼠（SPF級(jí)），體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（渝）2012-0002）］。

1.2 試藥與儀器 麝香酮（規(guī)格：每支50mg，純度≥98%，批號(hào)541913）購(gòu)自上海金穗科技有限公司，用0.01 g/mL的聚山梨酯80配成0.1 mg/mL懸濁液；光學(xué)顯微鏡（日本 OLYMPUS），高速臺(tái)式離心機(jī)（Backman CS-15R，美國(guó)Beckman公司），避暗穿梭測(cè)試儀（ZH-YLS-17B，淮北正華公司）。

1.3 造模與分組 按照簡(jiǎn)單隨機(jī)化方法分為正常組、假手術(shù)組、TBI創(chuàng)傷組、麝香酮組（0.9 mg/kg），每組在12 h、24 h、3 d、7 d 各 10 只。麝香酮組于致傷后每天腹腔內(nèi)注射麝香酮。假手術(shù)組、TBI創(chuàng)傷組給予等量等滲0.9%氯化鈉注射液。造模前，大鼠禁食8 h；用0.07 g/mL水合氯醛腹腔注射麻醉 （0.005 mL/g），麻醉成功后，頭部固定于腦立體定位儀上。于矢狀縫正中切開(kāi)頭皮，剝離骨膜，暴露左側(cè)頂骨，在冠狀縫后1.5 mm，中線旁左側(cè)2.5 mm處，用高速顱骨鉆鉆1個(gè)小孔，并擴(kuò)大為直徑5 mm的骨窗，保持硬腦膜完整，將“T”形撞桿置于應(yīng)硬膜外，用50 g砝碼從20 cm高處沿導(dǎo)管呈自由落體沖擊力為1000 g/cm，打擊后，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，致傷動(dòng)物蘇醒后原籠喂養(yǎng)。假手術(shù)組只開(kāi)骨窗。實(shí)驗(yàn)中死亡或癱瘓的大鼠重新造模補(bǔ)充。

1.4 避暗試驗(yàn) 大鼠避暗試驗(yàn)反應(yīng)儀分為明、暗兩室。箱底鋪以銅網(wǎng)，在暗箱通以40 V交流電。兩室之間設(shè)直徑8 cm的圓孔。首先將大鼠背向洞口放入明箱，由于大鼠趨暗的特性，則鉆入暗箱中，又因受電擊而進(jìn)入明箱。致傷后12 h、24 h，3 d、7 d進(jìn)行測(cè)試，記錄大鼠5 min內(nèi)進(jìn)入時(shí)間為潛伏期。潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)反映動(dòng)物的記憶水平，間接反映腦功能。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）HE染色觀察腦組織變化。各時(shí)間點(diǎn)大鼠用0.07 g/mL水合氯醛腹腔注射麻醉（0.005 mL/g），40 g/L多聚甲醛灌注取腦，切取以損傷灶為中心前后5min的大腦冠狀切面。常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片5～7 μm；切片在水浴鍋上進(jìn)行展片，再在載玻片上進(jìn)行貼片；二甲苯脫蠟15 min，乙醇固定；木精液染色5 min；用蒸餾水及乙醇沖洗后，0.005 g/mL伊紅染色1～3 min；二甲苯脫蠟15 min，乙醇固定；中性樹(shù)膠封片。2）Westernblot檢測(cè)MMP9蛋白的表達(dá)。組織經(jīng)過(guò)不同處理后，提取總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度；每孔30 μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別一抗（14-3-3 ν，1∶1000；β-actin，1∶2000）4 ℃下孵育過(guò)夜。 TBST 漂洗后，再加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后，采用化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差（ANOVA）分析，兩組均數(shù)的比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表1。與假手術(shù)組比較，TBI模型組大鼠錯(cuò)誤次數(shù)（進(jìn)入暗箱次數(shù)）增加（P＜0.05）；與TBI模型組比較，麝香酮組能減少錯(cuò)誤次數(shù)（進(jìn)入暗箱次數(shù)）（P＜0.05）。

表1 各組大鼠避暗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果比較（次，±s）

表1 各組大鼠避暗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果比較（次，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與TBI創(chuàng)傷組比較，△P＜0.05。下同。

12 h 24 h 3.00±0.00 4.00±0.00 TBI創(chuàng)傷組 15.40±2.00* 9.80±2.00*組 別 3 d 7 d假手術(shù)組 3.00±0.00 3.00±0.00 n 10 10 12.10±2.50*14.80±1.00*麝香酮組 10 7.40±1.50△ 10.40±2.00△ 11.30±1.00△ 5.70±1.40△

圖1 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織病理切片圖（HE染色，400倍）

2.2 HE染色觀察腦損傷變化 見(jiàn)圖1。假手術(shù)組：細(xì)胞間質(zhì)致密，細(xì)胞排列有序，各個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)腦細(xì)胞腫脹及間質(zhì)水腫，椎體細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞等未見(jiàn)細(xì)胞變性萎縮，毛細(xì)血管無(wú)擴(kuò)張，未見(jiàn)炎癥反應(yīng)，靜脈及動(dòng)脈結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)血栓形成。TBI創(chuàng)傷組：正常細(xì)胞間質(zhì)疏松、細(xì)胞排列雜亂，神經(jīng)元細(xì)胞減少、殘存神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，尼氏體溶解壞死（呈紫色），星型膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，有嗜神經(jīng)現(xiàn)象（即小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬壞死神經(jīng)元）、格子細(xì)胞（為吞噬了脂質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞）、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)有散在的凝固性壞死和部分膠質(zhì)細(xì)胞增生。腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管周圍亦可見(jiàn)炎性細(xì)胞袖套狀浸潤(rùn)。基底節(jié)纖維腫脹、崩解，靜脈受壓較動(dòng)脈更明顯，靜脈中可見(jiàn)血栓形成。麝香酮組：可見(jiàn)神經(jīng)元減少，有不同程度的恢復(fù)，排列趨于整齊，神經(jīng)基質(zhì)輕度腫脹，膠質(zhì)增生不明顯，受壓的動(dòng)脈及靜脈恢復(fù)，靜脈未見(jiàn)血栓形成。結(jié)果提示給大鼠靜注麝香酮后，能夠減輕大鼠創(chuàng)傷模型腦組織的病理學(xué)改變。

2.3 Westernblot檢測(cè)MMP9蛋白的表達(dá) 見(jiàn)圖2。TBI創(chuàng)傷組12 h MMP9蛋白表達(dá)開(kāi)始細(xì)胞開(kāi)始上升，在3 d達(dá)到頂峰，7 d后開(kāi)始下降，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。麝香酮組MMP9蛋白表達(dá)與TBI創(chuàng)傷組比較在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯降低（P＜0.05）。

圖2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)MMP9蛋白表達(dá)電泳條帶

3 討 論

TBI為神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率高，常常導(dǎo)致患者死亡或致殘，給社會(huì)及家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)［5］。TBI后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能發(fā)生改變，出現(xiàn)局部腦組織缺血缺氧、細(xì)胞水腫、顱內(nèi)壓增高，因此盡早改善損傷腦組織的缺血缺氧、細(xì)胞水腫、減少細(xì)胞凋亡，對(duì)患者預(yù)后及恢復(fù)功能有著重要的臨床意義。

麝香具有醒腦開(kāi)竅、通經(jīng)活絡(luò)的作用，目前研究證實(shí)麝香的主要活性成分為麝香酮，國(guó)內(nèi)研究表明低劑量麝香酮（0.9 mg/kg）對(duì)于大鼠缺血性再灌注損傷具有保護(hù)作用［6］。本試驗(yàn)選擇低劑量麝香酮觀察對(duì)大鼠TBI早期MMP9蛋白的表達(dá)情況，探討麝香酮神經(jīng)保護(hù)的可能機(jī)制。

大鼠創(chuàng)傷后12 h開(kāi)始出現(xiàn)神經(jīng)功能的下降，HE染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開(kāi)始腫脹、細(xì)胞基質(zhì)之間排列松弛、細(xì)胞排列紊亂，并且避暗實(shí)驗(yàn)也提示大鼠神經(jīng)功能下降。3 d時(shí)大鼠神經(jīng)功能明顯下降，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)有散在的凝固性壞死和部分膠質(zhì)細(xì)胞增生。腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管周圍亦可見(jiàn)炎性細(xì)胞袖套狀浸潤(rùn)，大鼠神經(jīng)功能下降最低；7 d時(shí)候細(xì)胞水腫減輕，大鼠神經(jīng)功能部分恢復(fù)。麝香酮組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)較TBI創(chuàng)傷組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)加快、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)恢復(fù)有不同程度的提升，提示麝香酮有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。

腦組織中血腦屏障主要由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管基底膜以及膠質(zhì)細(xì)胞終足構(gòu)成，血管基底膜與間質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)是維持血腦屏障完整結(jié)構(gòu)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。MMP9能降解和變性膠原類型Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ，破壞細(xì)胞外基質(zhì)成分包括膠原蛋白Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ、彈性蛋白和明膠。MMP9破壞了血腦屏障的完整性，通透性增加，導(dǎo)致血管源性腦水腫［7］。抑制MMP9蛋白表達(dá)活性，可以抑制NF-κb信號(hào)通路，抑制炎癥因子，自由基的表達(dá)，減少血腦屏障的破壞，減少細(xì)胞液的外滲，減輕血管源性腦水腫［8］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MMP9蛋白表達(dá)在12 h開(kāi)始表達(dá)，在3 d達(dá)到高峰，HE染色同樣提示，在3 d時(shí)候細(xì)胞及基質(zhì)排列紊亂達(dá)到高峰，大鼠神經(jīng)功能達(dá)到最低。因此抑制MMP9蛋白表達(dá)可能是治療顱腦外傷后一個(gè)分子靶點(diǎn)［9］。John H.Zhang認(rèn)為傳統(tǒng)中藥中活血化瘀、醒腦開(kāi)竅等藥物可能作用于大腦血管神經(jīng)單位，對(duì)腦保護(hù)有重要的臨床意義［10-11］。國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道麝香酮對(duì)缺血性腦梗死及心肌梗死具有保護(hù)作用［12-13］。麝香酮可以減少抑制MMPs的表達(dá)，減輕中風(fēng)后血腦屏障的破壞，麝香酮還能增強(qiáng)ATP酶活性，減少細(xì)胞的凋亡［14-15］。

綜上所述，我們推測(cè)麝香酮在TBI中發(fā)現(xiàn)的腦功能保護(hù)作用可能是通過(guò)減輕細(xì)胞的水腫，從而改善了細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)功能的改善。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)麝香酮組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MMP9蛋白表達(dá)較創(chuàng)傷組低，且大鼠神經(jīng)功能改善明顯，提示麝香酮可能是通過(guò)抑制MMP9蛋白表達(dá)從而改善了大鼠血腦屏障的破壞，減輕了腦水腫，促進(jìn)細(xì)胞的存活從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用，但麝香酮對(duì)腦減輕腦水腫的機(jī)制有待我們進(jìn)一步研究。

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