牛奶中殘留土霉素的高通量生物檢測法研究

江悅娟 張德勇（浙江樹人大學生物與環境工程學院 浙江杭州 310015）

引言

食品中抗生素殘留問題在我國較為嚴重，例如國家質檢總局曾有調查顯示,其檢測的八百份乳品樣品中抗生素殘留超標居不合格項目第一位。食品中殘留的抗生素可經食物鏈進入人體并長期蓄積，這些抗生素很多對人體有毒副作用。更嚴重的是由于抗生素濫用會促進耐藥菌產生，使人類將來或遭遇一些重大疾病“無藥可醫”的絕境[1]。當前抗生素的檢測方法卻很不健全。例如農業部《無公害農產品管理辦法》明確了60余種獸藥殘留限值，但公布的標準檢測方法卻僅有不到10種[2]。當前抗生素殘留的檢測方法如液相、氣相色譜法、免疫學檢測技術等，多具有精確、靈敏等優勢，但普遍存在儀器昂貴、需要專業人員、操作繁瑣、耗時長等缺點。因此開發一種操作簡單、廉價、高效的檢測技術具有現實意義。本研究擬通過測定微孔板上培養的敏感菌在培養過程中受抑制情況來計算抗生素的含量[3-6]。其適用領域與抑菌圈法相似，但具有高通量的優勢。

1 材料與方法

1.1 材料

藤黃微球菌[CMCC(B)28001]購自中國微生物菌種保藏中心。土霉素標準品購自中國獸醫藥品監察所。培養基、常規試劑、酶標儀等設備均由所在實驗室提供。

1.2 微生物的微孔板培養條件的建立

對藤黃微球菌進行吸光度全波長掃描，確定適用波長。并設計單因素法分別對微孔板培養法的菌液初始濃度（A450在0.1-0.7范圍）、培養時間（2h-5h范圍）、搖床速度（150-300rpm范圍）等條件進行優化，以對照孔與樣品孔的差值為優化依據。

1.3 抗生素濃度與菌液受抑制程度之間的線性關系建立

將倍比稀釋的抗生素(20μL/孔)加入含菌液（80μL/孔）的微孔板中，培養數小時后，測A450值。分析建立A450值增長受抑制程度與抗生素劑量之間的關系式，作為測定公式。

1.4 牛奶樣品前處理方法

取10 mL牛奶樣品,加10mL乙酸乙酯,超聲震蕩30 min,4000rpm離心10 min,乙酸乙酯層60℃旋轉蒸發,殘留物用2 mL甲醇溶解，待測。

1.5 檢出限測定

設計陰性對照孔與空白孔，按照前面建立的方法培養3h后測定A450值，計算增加值ΔA450。其中空白孔視為樣品孔進行測定和計算，得出對應的抗生素濃度值（μg/mL）。重復測定7次，并計算標準差值（SD）。檢出限（μg/mL）=SD×3。

1.6 準確度與精密度測定

人為制備含有已知含量抗生素的樣品，按照所建立的方法進行抗生素的前處理和含量分析。通過計算回收率反映本方法的準確度。回收率=測定濃度/理論濃度。用相對標準誤差（RSD）反映方法的精密度。RSD=標準誤差/算術平均值。

2 結果與討論

2.1 微生物的微孔板培養條件的建立

藤黃微球菌在可見光范圍沒有特征吸收峰，其吸光度與波長成反比，在紫外光區雖有一個峰，但穩定性欠佳。綜合考慮常規酶標儀的條件，本研究選擇450nm作為測定波長。菌液起始濃度，確定A450值在0.33左右為宜。搖床轉速以250rpm為宜。測定時間的選擇，以3h最佳，時間延長雖然差值更明顯，但X、Y兩個因素之間的線性規律出現紊亂，符合線性規律的范圍變窄。兩種微孔板的比較顯示96孔板好于48孔板。

2.2 抗生素濃度與菌懸液吸光度值抑制效應的線性方程建立

微孔板中的抗生素濃度與吸光度值之間是近似冪曲線。如果設定X=陰性對照孔ΔA450-樣品孔ΔA450；Y=土霉素的稀釋指數值；則X、Y之間存在線性關系，R2值分別為0.9837。經轉換后，微孔板中抗生素濃度計算公式如下：土霉素濃度（μg/mL）=0.15625*2^[33.795(ΔA0-ΔA)-1.9486]；其中 ΔA0為陰性對照孔的A450增加值，ΔA為待測孔的A450增加值。

2.3 檢出限、準確度與精密度

經計算，本方法的檢出限分別為0.0591ng/mL（以微孔板中的土霉素濃度表示）。本方法平均回收率為86.33%，RSD為6.37%。

結語

為了探索一種簡便高效的檢測土霉素殘留的生物法，以藤黃微球菌為指示菌，在96孔板上優化了其培養條件，新鮮菌液（A450約0.3）培養3h后，其A450值增長受抑制情況與抗生素的劑量之間存在相關性良好的回歸方程（R2=0.9837），故可根據生長受抑制程度計算抗生素含量。