丹酚酸B對EPCs釋放VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9細胞因子及EPCs黏附能力的影響

劉璐菘，王春田，王麗敏，劉 君，劉 鴻，白 劍，張麗艷*

0 引言

血管內皮祖細胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是一類具有增殖和分化能力的干細胞，作為血管內皮細胞的前體，其可以通過增殖和分化為血管內皮細胞，對受損的內皮組織進行修復[1]。常見的臨床心血管疾病如動脈粥樣硬化和冠心病，都是以血管內皮細胞損傷為主要特征。研究顯示，當血管內皮受損后，膠原組織暴露，存在于末梢血液循環中的EPCs可以通過動員、增殖和歸巢的方式黏附于膠原表面，并在其表面增殖、分化為血管內皮細胞[2-3]。但是，EPCs體內增殖緩慢，很難滿足臨床治療需要，國內外對EPCs的研究尚處于起步階段，因此，如何尋找到有效的方案幫助EPCs歸巢并增強EPCs活性具有臨床治療意義。

丹參又名長鼠尾草，中醫認為丹參味苦，微寒，入心、肝經，具有活血化瘀、通經止痛、涼血消癰、養血安神、消心除煩等功效[4-5]。而丹酚酸B作為丹參水溶性成分的主要提取物，具有多種藥理學活性，包括抗凝、抑制血小板聚集、抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化、保護血腦屏障和改善內皮細胞功能的作用。本研究在此基礎上，通過觀察丹酚酸B對離體的EPCs的黏附和旁分泌功能的影響，分析丹酚酸B修復血管內皮細胞的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 EPCs來源 經遼寧中醫藥大學附屬醫院倫理委員會批準，征得健康自愿者本人同意，取健康自愿者血液20 mL。

1.1.2 實驗試劑及儀器 丹酚酸B購于中國食品藥品檢定研究院；胎牛血清購于美國Hyclone公司；M199培養基和PBS購于美國GE公司；血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)和胰酶購于美國Sigma-Aldrich公司；CCK8試劑盒購于碧云天生物技術研究所；VEGF、基質細胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1,SDF-1)、白細胞介素8(Interleukin-8,IL-8)和基質金屬蛋白酶9(Matrix metalloprotein9,MMP9)酶聯免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購于美國Ebioscience公司；Percoll分離液購于美國GE公司；CD34-PE、VEGRF-2-APC和CD45-FITC購于美國BD公司；倒置相差顯微鏡購于日本Olympus公司；離心機購于湘儀公司；FACSCalibur流式細胞儀購于美國BD公司；550酶標儀購于美國Bio-Rad公司；細胞流動腔實驗裝置系統購于美國flexcell公司；CO2培養箱購于美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EPCs原代培養及鑒定 在無菌條件下，將20 mL健康人的末梢血中加入等體積的Percoll分離液，放入50 mL離心管中，1 500 r/min離心20 min，吸取液面交界處的有核細胞，使用PBS稀釋后1 500 r/min離心5 min。棄上清液，將離心后的細胞在含10%胎牛血清、10 ng/mL VEGF和3 ng/mL bFGF的M199培養基中培養24 h后，去除未貼壁的細胞，貼壁細胞繼續培養7 d。將細胞消化后，1 500 r/min離心5 min后棄去上清液，用PBS清洗2次，重懸細胞制備單細胞懸液并調整濃度為1×106個/ mL，取200 μL細胞懸液，分別加入CD34-PE、VEGRF-2-APC和CD45-FITC流式抗體各5 μL，避光室溫孵育20 min后，流式細胞儀檢測CD34、VEGRF-2和CD45的表達情況。

1.2.2 丹酚酸B促進EPCs的增殖 將培養7 d的血管內皮祖細胞用胰酶消化后，按照4×103個/孔的細胞量轉到96孔板中。加入含10%胎牛血清、10 ng/mL VEGF和3 ng/mL bFGF的M199培養基培養8 h，待細胞完全貼壁后，將細胞分為2組，對照組用10%胎牛血清、10 ng/mL VEGF和3 ng/mL bFGF的M199培養基，實驗組在對照組基礎培養基中加入不同濃度的丹酚酸B：20 μg/mL丹酚酸B組、40 μg/mL丹酚酸B組和60 μg/mL丹酚酸B組。將對照組和實驗組的細胞放入培養箱中培養4 d，每組均設置5個平行孔，隔天換液，每隔24 h進行1次CCK8試劑盒檢測，繪制細胞的生長曲線。

1.2.3 流動腔實驗 將光交聯膠原10 mg與丹酚酸B 40 μg、60 μg和80 μg充分混合后，加入2 mL蒸餾水充分溶解，覆蓋在玻片上，同時取光交聯膠原100 mg溶解2 mL蒸餾水作為對照組，將丹酚酸B和對照組混合后的蓋玻片置于紫外燈下交聯4 h。將分離培養7 d后的EPCs經胰酶消化后，用PBS洗去漂浮的死細胞，制成細胞密度為1×105/mL的細胞懸液。將含有EPCs的混懸液以0.01 mL/min流過涂層有膠原的玻片。通過倒置顯微鏡檢測EPCs流過相同距離的時間以及最終黏附在載玻片上的內皮祖細胞數量。

1.2.4 丹酚酸B促進EPCs旁分泌VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9 取EPCs貼壁后和實驗進行48 h后的培養基各200 μL，通過酶聯免疫吸附法檢測培養基中VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9的濃度，方法參照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 EPCs鑒定結果 使用倒置相差顯微鏡觀察EPCs呈梭形和多邊形，在細胞表面附著少量的懸浮細胞，細胞呈集落融合生長(圖1)。經過流式抗體CD34-PE、VEGRF-2-APC和CD45染色后，CD34、VEGRF-2和CD45 3種抗原標記物均為陽性的比例為89.11%±6.09%(圖2)。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察EPCs形態(40×)

圖2 培養7 d后EPCs表面抗原CD34、VEGRF-2和CD45鑒定結果

2.2 丹酚酸B促進EPCs的增殖實驗結果 每隔24 h采集細胞并進行光密度值檢測，第2、3、4天時，各濃度丹酚酸B組的光密度值與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，且細胞增殖與丹酚酸B的濃度相關。見表1。

2.3 流動腔實驗 取下載玻片，將其置于相差顯微鏡下，在×40目鏡下觀察細胞并計數，結果顯示，不同濃度丹酚酸B組每個低倍鏡視野的細胞計數與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表2。

2.4 丹酚酸B促進血管EPCs旁分泌VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9結果 不同濃度丹酚酸B培養4 d后，通過ELISA方法檢測培養基中VEGF、SDF-1、IL-8、MMP9的濃度。各濃度丹酚酸B組的VEGF、SDF-1、IL-8、MMP9濃度與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表1 不同濃度丹酚酸B培養后 EPCs增殖情況

注：與對照組比較，*P<0.05

圖3 流動腔實驗細胞黏附結果(×40)

組別細胞計數對照組98±1320μg/mL丹酚酸B組235±24*40μg/mL丹酚酸B組393±28*60μg/mL丹酚酸B組551±35*

注：與對照組比較，*P<0.05

3 討論

EPCs是一種具備分化潛能的前體細胞，在一定條件下可以分化為血管內皮細胞。最早發現EPCs的是日本學者Asahara，此后的研究證明，EPCs在心肌缺血的情況下可以被迅速動員，從骨髓進入到外周末梢血中，歸巢至缺血損傷的心肌組織，并可以分化為成熟的血管內皮細胞，參與缺血組織的修復[6]。現已證實，EPCs在多種心血管疾病中均有變化，包括冠心病、急性心肌梗死和缺血性腦卒中等[7-9]。以上疾病的共同點是機體出現短暫的缺氧狀態，由于低氧可以造成血管內皮受損并導致內皮細胞下的膠原暴露，如未得到及時有效的修復，血液循環中的炎癥細胞和血小板可以吸附于膠原組織表面，造成受損部位狹窄，甚至是栓塞等不良后果[10]。EPCs的修復則可以有效避免狹窄的形成，同時，EPCs還可以通過旁分泌作用釋放各種細胞因子，包括VEGF、bFGF、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating Factor，GM-CSF)、SDF-1、IL-8和MMP9等，這些細胞因子對促進EPCs的骨髓動員有著重要作用[11-13]。由于EPCs具有重要的生物學功能，臨床上已經開展了相關實驗，通過體外擴增EPCs方式回輸入人體，但這種方法也面臨一些風險，首先是回輸的EPCs不具有成血管的功能，其次是EPCs容易被體內巨噬細胞識別，最終轉化為泡沫細胞，反而使血管損傷加重[14-15]。因此，如何有效提高EPCs黏附，誘導產生有生物學功能的EPCs成為臨床治療的重要方向。

丹酚酸B是傳統中藥丹參活性最強的水溶性成分之一，是由三分子3,4-二羥基苯基乳酸和一分子咖啡酸縮合而成的低聚體型化合物[16]。研究顯示，丹酚酸B可以有效減少心肌梗死灶的范圍、改善心肌缺血和缺血-再灌注后的氧化應激損傷，修復受損的血管內皮細胞，防止血栓形成和改善受損組織的微循環等[17-18]。研究顯示，丹酚酸B可以促進骨髓間充質干細胞表達VEGF，并誘導骨髓間充質干細胞分化為心肌細胞[19]。同時，丹酚酸B還可以促進血管內皮細胞遷徙，促進單核細胞分泌VEGF和bFGF細胞活性因子，并幫助血管形成[20]。

目前認為血管內皮的修復有2種方式：受損組織周圍的血管內皮細胞分裂并遷徙至受損部位或者是由末梢血液中具有分化功能的EPCs分化而來[21]。丹酚酸B對受損血管的修復作用不明，因此，本研究從成人末梢血中分離培養了EPCs，經過20、40、60 μg/mL的丹酚酸B培養4 d后，檢測EPCs增殖的情況，結果發現，各濃度組丹酚酸B的EPCs增殖數量與對照組比較差異均有統計學意義。流動腔實驗結果顯示，不同濃度丹酚酸B交聯后的膠原表面吸附細胞數量明顯不同，且明顯高于對照組，并呈現出一定的濃度依賴性，表明丹酚酸B可以促進EPCs的增殖和黏附。EPCs具有旁分泌功能，這些細胞因子不僅可以動員EPCs從骨髓中進入外周血，還可以促進EPCs增殖、分化、趨化和歸巢[22]。VEGF是目前已知的誘導EPCs向成熟的血管內皮細胞分化的最重要的細胞因子，可以促進EPCs的骨髓動員，促進EPCs成熟，在EPCs增殖、分化、趨化和歸巢中起重要作用。SDF-1對EPCs的趨化作用是其他細胞因子的10倍以上，血液中SDF-1濃度升高有利于EPCs歸巢，誘發EPCs與受損內皮黏附和血小板聚集，并抑制EPCs凋亡，在診斷和治療心肌缺血性疾病中具有重要的臨床意義；IL-8可以通過激活CXCR2受體，磷酸化Ras和MAPK信號通路中的下游蛋白而介導EPCs的遷徙和增殖；MMP9最初報道來源于腫瘤的侵襲性研究，研究發現，MMP9可以增強腫瘤的侵襲性，可能與其降解膠原能力有關，MMP9還可以使EPCs在骨髓內募集并向外周血遷徙[23-25]。因此，本研究選取上述4種細胞因子，分析丹酚酸B在離體條件下對EPCs旁分泌功能是否有影響。結果顯示，不同濃度丹酚酸B在與EPCs共培養4 d后，可以明顯增加VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9在培養基中的濃度，由于在離體培養過程中排除了其他細胞的干擾，因此上述細胞因子的分泌只能是來源于EPCs的旁分泌功能。

表3 不同濃度丹酚酸B對EPCs培養基中VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9濃度的影響(pg/mL)

注：與對照組比較，*P<0.05

綜上所述，丹酚酸B作為丹參中主要的活性成分，在體外可以促進EPCs增殖和增強EPCs的黏附功能，同時可以刺激EPCs通過旁分泌作用釋放VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9等細胞活性因子，對于治療以血管內皮損傷為特征的疾病有著潛在的治療價值。

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