甘草指紋圖譜的研究進展

柯昌虎，嚴 慧，鄭 芳，陳琴華

0 引言

甘草(Licorice)是我國最為常見的中草藥之一，約60%的中藥配方中含有甘草。藥用甘草來源于烏拉爾甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)、脹果甘草(GlycyrrhizainflateBat)或光果甘草(GlycyrrhizaglabraL)的干燥根及根莖。現代藥理研究表明，甘草具有抗氧化、抗炎、抗病毒、解痙、抗癌、抗過敏、抗潰瘍、抗糖尿病等多種活性[1-2]，有關甘草化學成分研究表明，甘草主要含有三萜皂苷類、黃酮類、多糖等活性物質[2]。目前我國甘草屬植物共18種，植物來源、產地、變異類型、栽培條件、生產方式等方面的不同均使得甘草的成分組成和含量存在差異，且僅以甘草酸或甘草苷等某個單一指標成分難以完整而全面表現出甘草中藥材的質量優劣?；诨瘜W技術(色譜、光譜)與現代生物技術的指紋圖譜(Fingerprint)是近年來用于表征中藥中多成分特征的一種綜合性質量分析方法，可以較為全面地反映出中藥多成分體系的整體狀況，并能體現中藥成分的復雜性和相關性，與中醫藥的傳統理論相適應[3]，且已成為控制中草藥質量的有效手段。將指紋圖譜與中藥藥效評價相結合，基于“譜效關系”，可以確定中藥特定藥效物質基礎。本文就甘草指紋圖譜的研究成果進行綜述。

1 色譜指紋圖譜

1.1 液相

1.1.1 不同來源甘草的高效液相色譜分析 目前，高效液相色譜法(HPLC)應用最為廣泛，其分析速度快，信息量大，可以配置不同的檢測器，適用于甘草等各類中藥材及其制劑指紋圖譜的建立與分析。朱中佳等[4]采用HPLC建立了10個不同產地甘草藥材的指紋圖譜，指認出11個共有峰，相似度均大于0.9，從而為中藥甘草的質量控制提供依據。李成義等[5]建立了西北地區16批商品甘草的HPLC指紋圖譜，確認了10個特征峰，相似度均大于0.904，聚類分析結果顯示,16批甘草共聚為4類，該研究為西北地區商品甘草的質量評價和等級劃分提供了依據。Dong等[6]采用HPLC-DAD分析了種子經18 d太空飛行返回地面后培育生長的甘草，HPLC指紋圖譜顯示出12批樣品共有26個共有峰，且太空飛行組中異甘草素、異甘草苷、甘草素、光甘草定4種成分的含量明顯高于對照組，表明地外環境可能會影響其次生代謝產物的量，也為藥用植物的航天育種提供了科學數據。Chen等[7]采用LC-DAD-MS建立了葛根芩連配方顆粒的LC指紋圖譜，對其進行歸屬研究發現,其中有3個成分源于炙甘草。孫磊等[8]建立了10批產自不同地區炙甘草HPLC指紋圖譜，HPLC-MS/MS指認出19個共有峰中的6個指紋峰，相似度范圍為0.72～0.99，為炙甘草的質控提供了方法。另外，濮潤等[9]建立了不同地區甘草藥材的快速高效液相色譜(RRLC)指紋圖譜，LC-MS聯用技術結合對照化合物指認了其中6個色譜峰，70個產地甘草聚為脹果甘草和烏拉爾甘草兩大類，其中烏拉爾甘草數量占84%以上，且發現甘草素葡萄糖芹糖苷、甘草苷和甘草酸3個指標成分的聯合可以有效評價甘草品種，從而為甘草商品藥材的鑒別及質量控制提供依據。

1.1.2 甘草不同提取成分的高效液相色譜分析 張翠英等[10]采用RP-HPLC法建立了烏拉爾甘草水溶性成分的HPLC指紋圖譜，12批樣品中共確定了18個共有峰，其中4個特征指紋峰分別為甘草苷、異甘草苷、異甘草素和甘草酸，該研究為烏拉爾甘草藥材有效成分研究及其浸膏的質量控制提供了參考。蘇本正等[11]采用RP-HPLC法建立了甘草飲片乙酸乙酯提取部位HPLC指紋圖譜，比較了生炙飲片乙酸乙酯部位化學成分差異，10批甘草樣品測定結果發現：①不同產地甘草飲片圖譜與對照圖譜之間相似度均大于0.90；②甘草與炙甘草乙酸乙酯部位的化學成分有所不同，二者共有峰數目分別為10、8個，且蜜炙使甘草極性成分峰面積增大。該研究為闡明甘草蜜炙后增強藥效作用的物質基礎，為解析甘草蜜炙原理提供了依據。Zhang等[12]基于比較分析經口服進入消化系統中的甘草成分而建立多組分連續代謝方法，在250 nm下對甘草水提取物進行HPLC指紋圖譜分析，按照保留時間的不同標識出13個特征組分，確定出組分2、11分別為甘草苷和甘草酸，并采用LC-MS/MS鑒別出甘草水提取物中的一系列成分。

1.1.3 不同配伍比例甘草的高效液相色譜分析 劉穎等[13]采用RP-HPLC法建立了不同比例甘草海藻配伍的HPLC指紋圖譜，結果發現,甘草21個共有峰峰面積隨配伍比例的不同而變化，說明二者的配伍比例顯著地影響著甘草指紋圖譜。王亮等[14]采用HPLC對芫花甘草不同配伍比例的指紋圖譜進行比較，并用HPLC-ESI-MS對共有峰進行歸屬，發現二者配伍后成分的溶出減少，從而可能導致其藥理作用下降，其成果從化學成分角度為中藥配伍禁忌評價研究提供了思路和方法。陳梅等[15]采用血清HPLC指紋圖譜技術考察了芍藥甘草湯伍用的合理性，發現甘草單味藥有23個入血成分，配伍后二者的生物利用度明顯提高，可以產生相互協同作用。

1.1.4 譜效關系 以指紋圖譜為基礎，可以借助中藥的譜效關系來指導相應的藥效和藥理研究。陳云華[16]采用HPLC確定了甘草的指紋圖譜，發現不同來源甘草中甘草酸、甘草苷、異甘草素含量差異明顯，并采用誤差反傳人工神經網絡對藥材指紋圖譜和抗菌作用進行了組效建模和測試，指出可以通過指紋圖譜信息預測相關藥效。馬玲[17]建立了10個不同產地甘草黃酮及皂苷類成分的HPLC指紋圖譜，分別確定了11個共有峰和13個共有峰，氨水引咳實驗表明，甘草黃酮及皂苷類成分對氨水引起的咳嗽有一定的抑制作用，小鼠致肝損傷實驗表明，10個不同產地甘草皂苷類成分均能降低四氯化碳致肝損傷引起的AST、ALT升高，從而對肝損傷具有一定的保護作用。對甘草指紋圖譜及藥效學數據進行灰色關聯分析，發現甘草黃酮中有5個特征峰與鎮咳作用高度關聯，皂苷中有3個特征峰與血清中AST酶活力高度關聯、4個特征峰與血清中ALT酶活力高度關聯。

1.2 毛細管電泳 毛細管電泳法(CE)廣泛應用于甘草等中藥材及其制劑的鑒別及質量評價研究，特別適用于中藥中水溶性的極性成分分析。孫國祥等[18]采用毛細管區帶電泳法(CZE)，對6個廠家各10批以上復方甘草片進行指紋圖譜研究，評價不同批指紋與標準對照指紋間的相似性，結果表明，所建立的CE指紋圖譜具有較好的穩定性和重現性，可以用于復方甘草片的質量控制。周逸芝等[19]采用高效毛細管電泳法(HPCE)，建立了甘草飲片HPCE-DAD指紋圖譜分析方法，確定了10個共有峰，對甘草生品及其炮制品的指紋圖譜進行了比較，發現二者指紋譜中共有峰的相對峰面積差異較為顯著，該方法可用于評價甘草飲片的內在質量。智雪枝[20]也建立了21批復方甘草片的HPCE數字化指紋圖譜，確定了18個共有峰，考察了提取溶劑、運行電壓、背景電解質三者對電泳圖譜的影響，并應用系統指紋定量法判定了復方甘草片的質量等級。

1.3 薄層 薄層色譜(TLC)兼有定性和定量作用，可以提供直觀形象的可見光或熒光色譜圖像，TLC指紋圖譜可以在同一薄層板上同時比較多個樣品，并通過獲取指紋確定組合物的身份，成為植物原料或天然產物快速可靠的質量檢測工具。崔淑芬等[21]以乙酸乙酯-乙酸-甲酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑，于254 nm處對來自內蒙古的5個等級的甘草樣品進行薄層吸收掃描，建立了甘草樣品TLC指紋圖譜，發現6個共有峰，依此建立的柱狀條形碼圖可以快速評判藥材品質。在相同條件下又得到了來自不同產地的14個甘草藥材樣品的TLC指紋圖譜，也發現有6個共有峰，聚類分析發現，正品甘草藥材有較好的相似度且三維圖譜可對不同產地的甘草質量進行直觀比較[22]。進一步研究發現，微乳薄層色譜(METLC)指紋圖譜可以準確且有效地區分不同甘草樣品的特征組成成分，從而成為快速評價甘草質量的工具[23]。崔淑芬等[24]又建立了甘草的膠束薄層色譜(MTLC)指紋圖譜，通過優化得到最優膠束流動相為：0.23 mol/L SDS+16%(v/v)正丁醇+11%(v/v)甲酸，在展距為95 mm時分離得到17個色譜峰，且分離效果良好。另外，高效薄層色譜法(HPTLC)自動化程度高，可與其他色譜技術聯用，已成為天然產物中復雜化合物的有效分析工具[25]。Liu等[26]利用HPTLC準確地確定了甘草的多種組分，對其進行HPTLC指紋圖譜分析，發現有16個共有峰，其中8個指紋峰得到確認，且相似性很高，表明HPTLC可以快速、準確、有效地實現甘草質量的評價。

1.4 氣相 不同品種及采集時間的中藥揮發性成分出峰時間及含量存在差異，氣相色譜以此可將不同中藥進行有效區分，通過建立指紋圖譜來達到對原料藥、中藥材及其制劑質量控制的目的。禹曉梅[27]采用GC法對10批甘草藥材進行了研究，建立了不同產地甘草藥材氣相色譜指紋圖譜，發現不同產地的甘草中揮發油具有一定的相似性，相似度均在0.78以上，且藥材中十六酸的含量均很高。另外，不同產地甘草的成分組成大體相同，流出次序基本一致，且5、12、20、44、48 min左右10批藥材均有比較明顯的共有峰出現，可以判斷不同產地的甘草藥材揮發油的絕大部分成分是相同的，說明甘草間具有共性，但在甘草組分的含量上存在一定的差異。

2 光譜指紋圖譜

基于振蕩指紋圖譜等非線性化學原理，方宣啟等[32]提出了非線性化學指紋圖譜的概念，建立了甘草等中藥誘導時間相同的非線性化學指紋圖譜，相似度評價能夠很好地將甘草從其他中藥中鑒別出來，并確立了4個產地甘草中活性物質的當量關系。非線性化學指紋圖譜技術成為一種鑒別和評價甘草的新方法，也為其臨床使用提供了依據。

2.2 紅外 紅外光譜是鑒別化合物和確定物質分子結構的有力手段，適用的藥材范圍廣泛，對樣品無損傷，是藥物的專屬鑒別方法。高燕菁等[33]采用傅立葉變換紅外光譜法(FTIR)對4種批號且產地均為內蒙古的炙甘草進行質量鑒定，發現所建立的紅外指紋圖譜不僅能夠提供完整的特征圖像，準確而形象地鑒別藥材的真偽優劣，還可以判別各批次質量的相關性。莫文龍等[34]采用傅立葉紅外技術對4個不同產地的甘草樣品進行考察，建立其紅外指紋圖譜，聚類分析將樣品分為2個類別，且相同類別中化學組分十分相似，反映出在不同地理位置和氣候條件下甘草的多樣化，從而為甘草的質量評價和合理開發提供參考。

另外，楊天鳴等[35]采用近紅外漫反射(NIRS)技術對來自新疆、內蒙古(種植)、內蒙古(野生)、甘肅4個產地的甘草進行鑒別，建立其近紅外指紋圖譜。歐氏距離判別分析方法能夠清晰地反映出野生和種植的內蒙古甘草相似程度最高，新疆甘草較為接近，甘肅甘草則相差較大，而將其與PLSDA結合則可實現甘草等中藥材產地的快速準確鑒別。Wang等[36]通過多級紅外光譜(FT-IR、SD-IR和2DCOS-IR)建立了甘草的宏觀指紋圖譜分析方法，全面表征了甘草的整體及單個活性成分的指紋特征，從而有助于甘草等中草藥的綜合利用。

2.3 紫外 紫外(UV)指紋圖譜法根據藥材各成分之間的非對稱性關系和藥材自身具有遺傳穩定性和變異性的生物學特點，從整體上更為細致地反映藥材的成分信息。采用UV指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列法可以從整體或局部區別不同品種野生和種植甘草的遠近關系。鄒華彬等[37]采用氯仿、無水乙醇及水3種溶劑系統提取甘草中不同極性區間成分，建立了多維共有峰率和變異率雙指標序列紫外指紋圖譜，分析甘草樣品，發現野生甘草與種植甘草以及產地和品種不同的甘草之間差異顯著，該方法可以對兩個或多個甘草樣本進行可靠的鑒別。王玲[38]建立了黃芪、甘草等9種中藥的UV指紋圖譜，發現不同濃度的甘草水提醇沉液紫外吸收圖譜相似，200～500 nm區間內的紫外吸收值存在差異，在271.00 nm處甘草濃度與吸收值之間線性關系良好，借此可以對其進行定量分析，從而對中藥飲片及其提取物進行質量評價。張丹等[39]采用UV測定附子與甘草不同炮制品配伍前后總生物堿、酯型生物堿含量，結合指紋圖譜研究配伍前后附子甘草總體成分變化，發現配伍后附子總生物堿、酯型生物堿均降低，炙甘草降低的程度要高于生甘草；從指紋圖譜分析可知附子甘草配伍后，生甘草各成分的總加權變化率總體上有所降低，而炙甘草各成分的總加權變化率總體上有所增加，從而說明炙甘草解毒的作用強于生甘草，達到很好的減毒作用。

2.4 X射線 X射線圖譜可以反映出物質的固有屬性，使其具有指紋特性，重現性好、專屬性強，在中藥鑒別和質量評價中具有獨特的優勢和廣闊的應用前景。張麗娟等[40]采用粉末X射線衍射Fouirer指紋圖譜鑒定法，對甘草對照品(2個)和內蒙古產甘草樣品(8個)進行分析，獲得了甘草的標準X射線衍射Fouirer指紋圖譜及特征標記峰值，結果發現：①甘草藥材對照品1#和2#具有一致的幾何拓撲圖形，共有40個衍射峰值，其中有3個特有的衍射特征標記峰，衍射峰一致程度分別為91%、87%；②第一類甘草藥材3#～6#具有一致的幾何拓撲圖形，共有30個衍射峰值，其中有6個特有的衍射特征標記峰，衍射峰一致程度分別為83%、71%、75%、79%；③第二類甘草藥材7#～10#甘草藥材對照品具有一致的幾何拓撲圖形，共有25個衍射峰值，其中有10個特有的衍射特征標記峰，衍射峰一致程度分別為86%、63%、63%、76%；④所有甘草藥材均含有α-石英、一水草酸鈣，且含量各自存在差異。以上結果表明，X射線衍射Fouirer指紋圖譜中的幾何拓撲圖形與衍射特征標記峰值可以作為甘草藥材的鑒定依據。

2.5 NMR1H NMR和13C NMR是鑒別中藥中有機化合物結構的有力手段，其指紋圖譜具有高度的特征性和重現性，且與植物品種間存在十分準確的對應關系，特別適用于中草藥的真偽鑒別和質量評價。Farag等[41]研究發現，在600 MHz下，以氘代甲醇作為溶劑，光果甘草1H NMR圖譜顯示有3個特征區域：①查爾酮和黃烷酮類的芳香質子(5.5～8.0 ppm)，②糖單元的異頭質子(4.0～5.5 ppm)，③甘草酸的甲基、亞甲基和次甲基(0.8～3.2 ppm)。在其芳香區域(5.5～9.0 ppm)中甘草查爾酮A信號相當強。以上數據均表明，NMR代謝指紋分析可以有效區分脹果甘草和其他3個品種。

3 聯用技術

聯用技術的運用實現了色譜法與波譜法的有力結合，它兼具分離能力和結構鑒別能力，已成為中藥品種鑒別和質量評價的有效方法。段天璇等[42]以甲醇為溶劑對內蒙古野生和人工栽培的烏拉爾甘草以及新疆脹果甘草進行提取，建立其甲醇提取物的HPLC-DAD及HPLC-MS指紋圖譜，結合文獻推斷出17個色譜峰中19個可能的成分，并發現野生和栽培、野生不同品種甘草的色譜峰的數量不同、相同色譜峰的峰面積存在差異，從而為甘草質量、品種、種植及譜效關系等各類研究提供較全面的化學依據。王愛潮等[43]建立了14批溫膽湯的UPLC-UV指紋圖譜，共標記了22個共有峰，相似度在0.863～0.998，分別以內蒙古3個產地的甘草作為陰性對照品，發現3號、9號、10號、18號和20號峰來源于甘草；UPLC-MS/MS法定性分析發現9號色譜峰為甘草苷，18號色譜峰為甘草酸，所建立的UPLC-UV-MS/MS指紋圖譜方法可靠、準確，可以將其應用于溫膽湯等復方的質量控制。

Farag等[41]對刺果甘草、脹果甘草、光果甘草及烏拉爾甘草根部的代謝物和指紋圖譜進行了比較分析，LC-MS分析結果顯示，包括三萜皂苷類、黃酮類和香豆素類在內共有61個化合物，其中有46個得到確認，所有化合物中皂苷類的豐度最高。采用GC-MS對甘草代謝產物進行分析，發現主要代謝物為糖類、脂肪酸和酚酸。在刺果甘草中，糖類和酚酸衍生物含量較高，其他甘草品種中類黃酮和甘草酸的含量占據優勢，聯用技術的使用有助于確定物種之間的關系。

4 生物指紋圖譜

中藥生物指紋圖譜是從分子水平揭示中藥及其與細胞作用后的基因和蛋白的表達特征，研究解決化學成分和藥理作用、藥效活性的相關性，對于中藥品種鑒別更加準確可靠。

周成明等[44]采用AFLP標記技術對烏拉爾甘草栽培新品系“民勤1號”、“喀什1號”、“阿克蘇1號”和常規栽培品系內蒙古烏拉爾甘草進行遺傳基礎研究，篩選得到8對引物組合，對其進行多態性分析，并以E-AAC/M-CAG組合構建不同來源甘草的指紋圖譜，UPGMA聚類分析將4個來源甘草分為4組，表現出不同的親緣關系，“民勤1號”、“喀什1號”、“阿克蘇1號”三者的基因構成較為獨特，可以作為選育品種進行深入研究。

劉婷[45]采用ISSR分子標記法對甘草、脹果甘草和光果甘草3種藥用甘草進行遺傳多樣性研究，5條引物對60份DNA樣品進行ISSR擴增，共擴展出886條有效條帶，其中多態性條帶共498條，甘草、脹果甘草和光果甘草的多態率分別為48.57%、62.86%和57.14%，三者多態性條帶分別為148、187和162條，采用UPGMA聚類法發現三者Nei氏遺傳距離分別為0.44、0.47和0.52，三者Nei氏相似系數范圍為0.45～0.51，甘草與脹果甘草、光果甘草的遺傳相似系數分別為0.51和0.45，且發現ISSR分子標記指紋圖譜法和化學色譜指紋圖譜法所得結果具有一致性，從而為甘草資源的利用和撫育提供了科學依據。

5 小結

甘草是我國常用的中藥材，種類多，質量不一。植物來源、藥材產地、生產方式等因素均顯著影響甘草的質量，僅以其單個成分也難以完整反映甘草的真實品質，對其制定科學可靠的質量評價體系顯得尤為重要。甘草化學指紋圖譜技術主要借助光譜、色譜等現代先進技術手段，可以較為全面地反映甘草所含化學成分的真實情況，進而對其質量進行整體描述和評價。甘草生物指紋圖譜則在分子水平上反映其遺傳多樣性，已成為真偽鑒別的有力手段。因此，綜合運用各種現代技術對甘草進行深入全面的分析研究，不僅可以進一步明確甘草藥效的物質基礎，全面控制甘草藥材及飲片的質量，還可以進一步完善其鑒別體系和質量評價系統，為甘草的合理開發和應用提供科學依據。

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