七氟烷對大鼠近期空間回憶能力、海馬APOE、Aβ表達的影響*

徐珊，朱昭瓊，王義，唐春春，張超

（1.遵義醫學院 貴州省麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室，貴州 遵義 563000；2.遵義醫學院附屬醫院 麻醉科，貴州 遵義 563003）

近年來，術后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）發病機制的研究主要集中在類阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）途徑。AD核心病理改變是β淀粉樣蛋白（amyloid β，Aβ）沉積，其形成、沉積、降解、啟動并貫穿AD的整個病理過程[1]。研究證實，吸入麻醉藥七氟烷可導致海馬Aβ沉積并損害大鼠學習記憶能力[2]。Aβ由淀粉樣前體蛋白（Amyloid precusor protein，APP）經β、γ分泌酶連續作用后產生，多因素參與該過程，其中載脂蛋白（apolipoprotein E，APOE）基因多態性可導致APP異常降解，大量Aβ沉積，進一步損害生物膜和破壞細胞內鈣離子穩定[3]。本實驗通過觀察七氟烷麻醉后大鼠行為學改變及海馬APOE、Aβ變化，揭示七氟烷對成年大鼠近期空間回憶能力和海馬Aβ表達的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑

MT-200型Morris水迷宮測試儀（成都泰盟科技有限公司），Fabius麻醉機、Vamos氣體監護儀（德國Drager公司），吸入型七氟烷（臨沂魯南貝特制藥有限公司，批號65150103），Aβ抗體（美國Abcam公司），APOE抗體（北京博奧森生物技術有限公司），GTVisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫組織化學檢測試劑盒（上海基因科技有限公司）。

1.2 實驗動物及分組

健康成年SPF級雄性SD大鼠54只，體重300 g左右，由第三軍醫大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（渝）2012～0005。采用隨機數字表法隨機分為七氟烷麻醉組、運載氣體組、空白對照組，每組18只。在模型復制后第1天（T1）、第3天（T3）和第7天（T7）取腦組織，采用免疫組織化學法檢測海馬CA1區、CA3區、DG區APOE、Aβ的平均光密度值（mean optical density，MOD）。

1.3 麻醉模型的復制

自制有機玻璃吸入麻醉箱，規格75 cm×30 cm×15 cm，兩端側孔經螺紋管與麻醉機相連，氣體監護儀經側孔監測箱內七氟烷濃度。箱底鋪2 cm厚鈉石灰。麻醉前1 d將實驗大鼠置于麻醉箱內，讓其自由活動15min，以熟悉麻醉箱內的環境，防止麻醉初期出現驚恐不安。七氟烷麻醉組吸入3.2%七氟烷+運載氣體（1 L/min 氧氣O2+1 L/min空氣）2 h，運載氣體組吸入運載氣體2 h，空白對照組自然飼養。觀察并記錄模型復制過程中大鼠呼吸頻率、皮膚、黏膜顏色。

1.4 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮實驗包括適應性訓練1 d、定位航行實驗5 d、空間探索實驗1 d。適應性訓練排除游泳障礙的大鼠。定位航行實驗：將大鼠面向盆壁，依次從4個象限中點置入水中，記錄從入水到登上平臺時間（逃避潛伏期）、游泳距離，時限120 s，在規定時限內未找到平臺則記錄120 s，并將大鼠引至平臺停留10 s。空間探索實驗：撤去平臺，以平臺對側象限作為入水點，時限120 s，記錄穿越原平臺次數、進入原平臺象限次數、原平臺象限滯留時間、原平臺象限滯留時間百分比。水溫（25±1）℃，平臺置于水面下2 cm，水中混入奶粉隱蔽平臺，每天上午10:00測試。各組大鼠于模型復制前、取材前行Morris水迷宮實驗。

1.5 免疫組織化學法

腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg），冰盤上取腦組織，4%多聚甲醛固定、石蠟包埋（暴露海馬冠狀面）、切片厚3μm。免疫組織化學SP法檢測Aβ、APOE的表達，切片脫蠟、脫水，高壓修復暴露抗原，一抗（Aβ抗體1∶200稀釋，APOE抗體1∶100稀釋）、二抗依次結合，DAB顯色，蘇木精復染，鏡檢、封片、拍攝圖像。應用Image-Pro Plus系統分析。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，逃避潛伏期的比較，采用隨機區組設計的方差分析（Mauchly球形檢驗，P＜0.10時，校正F值），空間探索實驗和生化指標的比較，采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型復制前各組大鼠逃避潛伏期比較

模型復制前行定位航行實驗，各組大鼠逃避潛伏期隨訓練天數增加逐漸縮短（T1：F=9.815，P=0.001；T3：F=33.071，P=0.000；T7：F=14.943，P=0.000）。空白對照組、運載氣體組和七氟烷麻醉組逃避潛伏期比較，經方差分析，差異無統計學意義（T1：F=0.771，P=0.631；T3：F=0.779，P=0.624；T7：F=1.394，P=0.242）。見表 1 和圖 1。

2.2 模型復制前各組大鼠空間探索實驗結果比較

模型復制前空間探索實驗中，各組穿越原平臺次數、進入原平臺象限次數、穿越原平臺象限時間及穿越原平臺象限時間百分比比較，經方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。

2.3 模型復制后各組大鼠空間探索實驗結果比較

模型復制后，比較T1、T3、T7時間點各組 空間探索實驗結果，穿越原平臺次數、進入原平臺象限次數、穿越原平臺象限時間及穿越原平臺象限 時間百分比比較，經方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.4 大鼠海馬各區Aβ表達情況比較

T1、T3時間點各組大鼠海馬各區Aβ表達水平比較，經方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）。T7時間點各組大鼠海馬各區Aβ表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，T7時間點運載氣體組海馬CA1區、CA3區、DG區Aβ的MOD值與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與運載氣體組比較，T7時間點七氟烷麻醉組大鼠海馬各區Aβ的MOD值增高（P＜0.05）。見圖 2和表 4。

2.5 大鼠海馬各區APOE表達情況比較

T1、T3時間點各組大鼠海馬各區Aβ表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。T7時間點各組大鼠海馬各區Aβ表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＞0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，T1、T3時間點運載氣體組大鼠海馬CA1區、CA3區、DG區APOE的MOD值與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與運載氣體組比較，T1、T3時間點七氟烷麻醉組大鼠海馬各區APOE的MOD值降低（P＜0.05）。見圖3和表5。

表1 模型復制前各組大鼠逃避潛伏期比較 （n =6，s，±s）

表1 模型復制前各組大鼠逃避潛伏期比較 （n =6，s，±s）

空白對照組 46.89±20.86 20.78±17.91 20.96±7.68 11.84±4.42 10.00±6.29運載氣體組 56.13±31.51 29.56±18.49 11.60±6.07 8.69±4.68 8.49±4.74

圖1 各組大鼠逃避潛伏期比較

表2 模型復制前各組大鼠空間探索實驗結果比較 （n =6，±s）

表2 模型復制前各組大鼠空間探索實驗結果比較 （n =6，±s）

?

表3 模型復制后各組大鼠空間探索實驗結果比較 （n =6，±s）

表3 模型復制后各組大鼠空間探索實驗結果比較 （n =6，±s）

空白對照組 4±2 23±9 27.21±8.18 23.17±6.96運載氣體組 4±2 22±6 26.04±7.7 22.15±6.55七氟烷麻醉組 5±1 27±5 33.67±5.77 26.88±1.68 F值 0.582 1.105 1.908 1.188

圖2 七氟烷麻醉組和運載氣體組大鼠海馬Aβ的表達（×40）

表4 各組大鼠海馬各區Aβ的MOD值比較（n =6，±s）

表4 各組大鼠海馬各區Aβ的MOD值比較（n =6，±s）

空白對照組 0.17±0.02 0.17±0.02 0.17±0.02運載氣體組 0.17±0.01 0.17±0.02 0.17±0.02七氟烷麻醉組 0.19±0.02 0.19±0.02 0.20±0.02 F值 8.828 4.907 14.381

圖3 七氟烷麻醉組與運載氣體組海馬APOE的表達（×40）

表5 各組大鼠海馬APOE的MOD值比較（n =6，±s）

表5 各組大鼠海馬APOE的MOD值比較（n =6，±s）

空白對照組 0.17±0.03 0.18±0.02 0.19±0.02運載氣體組 0.18±0.04 0.19±0.03 0.21±0.04七氟烷麻醉組 0.17±0.02 0.19±0.02 0.22±0.03 F值 0.906 1.119 3.052

3 討論

POCD主要表現為學習記憶能力下降、注意力無法集中[4]，這一術后常見并發癥長久以來困擾著麻醉醫生和患者。新型吸入麻醉藥七 氟烷具有誘導迅速、蘇醒快、麻醉過程平穩等優點，廣泛應用于臨床。基礎研究表明，吸入麻醉藥可致嚙齒類動物學習記憶能力改變[5-6]，但具體機制未完全闡明。

成年大鼠最低肺泡有效濃度（minimum alveolar concentration，MAC）為2.4%[7]，七氟烷99%有效劑量為1.3 MAC[8]，本實驗模擬臨床，采用3.2%七氟烷復制吸入麻醉模型。為避免純氧對本實驗的干擾，采用1 L/min O2+1 L/min空氣作為運載氣體并設立空白對照組。模型復制后空白對照組與運載氣體組的穿越原平臺次數、進入原平臺象限次數、原平臺象限滯留時間、原平臺象限滯留時間百分比，以及海馬Aβ、APOE的MOD值無差異，排除運載氣體對本實驗的干擾，實驗結果真實可靠。

各組大鼠模型復制前逃避潛伏期隨著訓練天數增加逐漸縮短，各組大鼠組間比較無差異。空間探索實驗中，各組穿越原平臺象限次數、進入原平臺象限時間、原平臺象限滯留時間及原平臺象限滯留時間百分比無差異，說明模型復制前大鼠建立了穩定的學習記憶能力，且各組大鼠空間探索及回憶探究能力無差異，基線一致。

模型復制后，七氟烷麻醉組大鼠穿越原平臺次數、進入原平臺象限次數、原平臺象限滯留時間及原平臺象限滯留時間百分比與運載氣體組比較無差異，提示臨床常用濃度七氟烷不會損害成年大鼠近期空間聯想與回憶探究能力，推測臨床工作中近期POCD的發生與患者年齡、疾病、手術等因素關系更大，而吸入麻醉藥七氟烷不是近期POCD發生的主要危險因素。

吸入七氟烷后第1天、第3天海馬各區APOE表達下降，Aβ無明顯變化；模型復制后第7天海馬各區APOE表達正常，Aβ增高。由此可見，APOE與Aβ變化趨勢一致，低水平的APOE將Aβ維持在正常水平，T7時間點APOE恢復正常時Aβ出現沉積。APOE并非Aβ生成的唯一相關因素。大量研究證實，早老蛋白、乙酰膽堿等與Aβ變化有關[9-10]。由此推測，七氟烷可能經其他途徑引起海馬Aβ增加，同時下調APOE表達，抑制海馬Aβ沉積，使Aβ總體水平維持在正常范圍。然而，這種作用存在一定時限性，術后第7天是Aβ增加的關鍵時間點，應警惕七氟烷損害成年大鼠遠期空間回憶能力。

綜上所述，3.2%七氟烷不會引起術后早期成年大鼠海馬各區Aβ沉積，該作用是通過下調APOE表達來實現的；吸入七氟烷后第7天是海馬各區Aβ增加的關鍵時間點，但此時尚未能引起大鼠空間回憶能力損害。

[1]MOKHTAR S H, BAKHURAYSAH M M, CRAM D S, et al.The beta-amyloid protein of Alzheimer’s disease: communication breakdown by modifying the neuronal cytoskeleton[J]. Int J Alzheimers Dis, 2013, 2013: 910502.

[2]YUE T, SHANBIN G, LING M, et al. Sevoflurane aggregates cognitive dysfunction and hippocampal oxidative stress induced by β-amyloid in rats[J]. Life Sci, 2015, 143: 194-201.

[3]CHRISTIANE R, RICHARD M. Use of genetic variation as biomarkers for mild cognitive impairment and progression of mild cognitive impairment to dementia[J]. Alzheimers Dis, 2010, 19(1):229-251.

[4]SATO C, SEKIGUCHI A, KAWAI M, et al. Postoperative structural brain changes and cognitive dysfunction in patients with breast cancer[J]. PLoS One, 2015, 10(11): DOI: 10.1371/journal. pone.0140655.

[5]ZHANG F, ZHU Z Q, LIU D X, et al. Emulsified isoflurane anesthesia decreases brain-derived neurotrophic factor expression and induces cognitive dysfunction in adult rats[J]. Exp Ther Med,2014, 8(2): 471-477.

[6]劉建慧, 張曉慶, 王毅龍, 等. 不同濃度不同時間七氟烷對小鼠認知功能的影響[J]. 中華麻醉學雜志, 2015, 35(6): 684-686.

[7]WANG Q J, LI K Z, YAO S L, et al. Different effects of iso fl urane and sevo fl urane on cytotxicity[J]. Chin Med J (Engl), 2008, 121(4):341-346.

[8]陳龍, 左明章, 劉功儉, 等. 七氟醚麻醉對幼鼠海馬c-Jun氨基末端激酶表達和神經細胞凋亡的影響[J]. 中華麻醉學雜志,2011, 5(3): 563-565.

[9]CHEN G J, XIONG Z, YAN Z. Aβ impairs nicotinic regulation of inhibitory synaptic transmission and internueuron excitability in prefrontal cortex[J]. Mol Neurodegener, 2013, 8: 3.

[10]ZHANG X L, KRASSIMIRA G, KARTHIKEYANNV, et al. A role for presenilins in autophagy revisited: normal acidi fi cation of lysosomes in cells lacking PSEN1 and PSEN2[J]. The Journal of Neuroscience, 2012, 32(25): 8633-8648.