MRI評(píng)價(jià)抗腫瘤中藥康萊特注射液療效的實(shí)驗(yàn)研究

李曉琴，朱紅革，劉春玲

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肺內(nèi)二科，新疆 烏魯木齊 830011）

康萊特對(duì)于中晚期肺癌、肝癌及結(jié)直腸癌等具有一定的療效，同時(shí)還能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)放、化療殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。大量研究表明，其具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)免疫等綜合效果[1]。隨著現(xiàn)代醫(yī)藥研發(fā)和中醫(yī)藥逐步結(jié)合，將有大量的抗癌中藥用于腫瘤患者[2]。抗腫瘤藥物的研發(fā)和臨床實(shí)驗(yàn)需要確定腫瘤藥物治療的最佳作用時(shí)間和藥物濃度、藥物療效和機(jī)體副作用間的平衡，以及殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制，因此需要進(jìn)行實(shí)時(shí)有效的監(jiān)測(cè)腫瘤變化，這些都是病理學(xué)檢測(cè)所不具備的[3]。分子影像學(xué)技術(shù)是將一種或者幾種具有成像功能的分子標(biāo)志物打入到體內(nèi)，這些標(biāo)志物能夠與體內(nèi)腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，在影像學(xué)下顯示腫瘤病變的各種信息[4]。現(xiàn)在很多抗腫瘤藥物就是基于腫瘤的血管依賴性進(jìn)行設(shè)計(jì)的[5]。目前，診斷血管新生的金標(biāo)準(zhǔn)是微血管密度（microvascular density，MVD），然而其測(cè)量方法創(chuàng)傷大，不能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和反復(fù)測(cè)量，不能應(yīng)用于抗腫瘤藥物療效的檢測(cè)[6-7]。臨床上，MRI廣泛用于評(píng)價(jià)腫瘤的生成狀況，可作為一種有效的手段，持續(xù)評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物的療效[8]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

免疫組織化學(xué)染色試劑盒、DAB濃縮試劑盒、PBS濃縮粉末、枸櫞酸修復(fù)液購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司，CD34、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcom生物技術(shù)公司，Aneexin-V FITC/PI凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），VEGF酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒、癌胚抗原ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州慧嘉生物科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞及分組

康萊特注射液（浙江康萊特藥業(yè)有限公司）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用BALB/c-nu裸鼠，共20例，均為雄性，鼠齡6～8周，體重約18 g。

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29（上海生命科學(xué)研究院的細(xì)胞庫(kù)）。取4～6代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，生長(zhǎng)狀態(tài)差或者代數(shù)高的細(xì)胞均不用于實(shí)驗(yàn)。

裸鼠的右后肢皮下接種人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞成瘤，其中10例為對(duì)照組，腹腔注射0.9%氯化鈉注射液1 ml/（d·只）；10例為治療組，腹腔注射1 ml康萊特注射液1 ml/（d·只），兩組治療時(shí)間均為7 d。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)與傳代復(fù)蘇后的細(xì)胞傳代≥1代后用于實(shí)驗(yàn)，以減少凍存液對(duì)細(xì)胞的損傷和對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。本實(shí)驗(yàn)選取第4～6代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.2 細(xì)胞增殖與凋亡細(xì)胞增殖與凋亡采用5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EDU）細(xì)胞增殖檢測(cè)及Annexin-V FITC/PI凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

1.3.3 HT-29細(xì)胞成瘤接種液的制備及皮下接種取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，PBS清洗3次后，用無(wú)菌PBS制成接種腫瘤細(xì)胞懸液，在潔凈操作室中接種1 ml至裸鼠的右后肢皮下組織，接種時(shí)注意無(wú)菌操作。由2位測(cè)量者用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤底部的最大（a）和最小直徑（b），按照公式體積（V）=ab2π/6，計(jì)算各組裸鼠皮下成瘤的體積大小，對(duì)照組皮下成瘤體積＞200 mm3表明本實(shí)驗(yàn)成瘤操作成功。

1.4 MRI的檢測(cè)方法

1.4.1 MRI的檢測(cè)時(shí)間和設(shè)備待裸鼠右下肢的皮下成瘤大小達(dá)到模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)，10～15 d時(shí)進(jìn)行MRI掃描檢測(cè)。采用1.5T Tim Avanto 磁共振掃描儀（德國(guó)西門子公司）檢測(cè)腫瘤的大小和血管情況，采用上海辰光醫(yī)療科技公司研發(fā)的25 mm實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專用射頻線圈進(jìn)行裸鼠的MRI掃描（專利號(hào)：ZL201020236347.3）。

1.4.2 裸鼠的麻醉采用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，麻醉前在天平上精確測(cè)量裸鼠的體重，按照0.4 ml/100 g的劑量進(jìn)行腹腔麻醉。

1.4.3 MRI成像參數(shù)設(shè)定MRI的具體參數(shù)根據(jù)掃描序列進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)所得的MRI掃描序列、參數(shù)及圖像，T1WI-TSE序列：TR=280，TE=18，層厚2 mm，層間距0.0 mm，層數(shù)10層，F(xiàn)OV=70，信號(hào)平均次數(shù)（number of signal averaged，NSA）3次，矩陣256×256；T2WI-TSE序列：TR=3 000，TE=82，層厚2 mm，層間距0.0 mm，層數(shù)10層，F(xiàn)OV=70，NSA 3次，矩陣512×512；磁共振彌散加權(quán)成像（diffusion weighted imaging，DWI）序列：10個(gè)擴(kuò)散敏感梯度因子b值，分別為0、50、100、150、200、250、300、500、750 和 1 000 s/mm2，TR=24 00，TE=101，層厚2 mm，層間距0.0 mm，層數(shù)10層，F(xiàn)OV=60，NSA 6次，矩陣80×80。

1.4.4 圖像的處理和分析采用Biomap軟件處理DWI圖像，首先計(jì)算出ADC值并繪出ADC圖像，先根據(jù)10個(gè)b值擬合出ADC10b圖，再分別取3個(gè)低b值（0、50和100 s/mm2）擬合出ADClow圖，提取3個(gè)高b值（500、750和1 000 s/mm2）擬合出ADChigh圖，將ADClow與ADChigh的差值定義為ADCperf值。根據(jù)0、500和1 000 s/mm2擬合出ADC3b圖，每個(gè)ADC值的計(jì)算提取≥3個(gè)不同的b值，以便提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，最后分析出腫瘤組織的感興趣區(qū)及其像素分布。

1.5 瘤體的大小與取材

接受結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞注射的裸鼠采用單個(gè)籠喂養(yǎng)，并堅(jiān)持每隔一段時(shí)間更換墊料和食物，保證裸鼠喂養(yǎng)環(huán)境的潔凈和干燥，并預(yù)防各種病原體的感染。一段時(shí)間后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉裸鼠后，用相機(jī)拍照，記錄成瘤體的大小。用IPP 6.0軟件計(jì)算各組瘤體的大小及組間差異。每次拍照后，用剪刀分離皮下的成瘤體，取下整個(gè)成瘤體，PBS清洗后，用4%多聚甲醛固定。根據(jù)MRI掃描圖像，實(shí)驗(yàn)選取與橫斷位對(duì)應(yīng)的腫瘤最大橫徑切面進(jìn)行石蠟切片。每個(gè)樣本切6張組織切片，切片厚度4μm。

1.6 免疫組織化學(xué)法

包埋成瘤體組織，石蠟切片，切片脫蠟。封閉抗原，孵育一抗、二抗。抗原、抗體結(jié)合顯色，切片復(fù)染、脫水、封片。

1.7 MVD的測(cè)定

使用CD34抗體染色，判定標(biāo)準(zhǔn)采用Weidner改進(jìn)式方法。先在低倍鏡（×100）下掃視整個(gè)玻片，找出MVD最大的熱點(diǎn)后，變換高倍鏡（×200）觀察并計(jì)數(shù)。任何被抗體染成棕色的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，不管有無(wú)形成管腔，只要與周圍的微血管、腫瘤組織及其他結(jié)締組織界限清楚，都作為1條可計(jì)數(shù)的血管。腫瘤內(nèi)硬化區(qū)，以及與腫瘤交界處軟組織內(nèi)的微血管不作計(jì)數(shù)；具有厚的平滑肌或管腔面積＞8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管也排除在外。記錄5個(gè)視野的微血管數(shù)，取其平均數(shù)作為MVD。

1.8 VEGF的測(cè)定

使用VEGF單克隆抗體染色，采用兼顧VEGF陽(yáng)性染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。在排除非特異染色前提下，按染色強(qiáng)度計(jì)分：0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積＞3分為免疫反應(yīng)陽(yáng)性。并按乘積分?jǐn)?shù)分為4個(gè)等級(jí)：0～2分為陰性（-）、3～5分為弱陽(yáng)性（+）、6～8分為陽(yáng)性（++）、9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)或方差分析；計(jì)數(shù)資料以率表示用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 康萊特注射液對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的影響

加入康萊特注射液作用7 d后，兩組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖率比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療組較對(duì)照組降低33.113%。見(jiàn)表1和圖1。

2.2 康萊特注射液對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡的影響

兩組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡率比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療組較對(duì)照組升高28.243%。見(jiàn)表2和圖2。

2.3 康萊特抑制裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)

在裸鼠皮下接種人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞后5 d，裸鼠在右后肢出現(xiàn)米粒大小的小成瘤體，未見(jiàn)潰瘍，皮膚光滑完整，證明模型復(fù)制成功。接種15 d后，接種部位出現(xiàn)明顯隆起，其體積均達(dá)到300 mm3，瘤體質(zhì)地硬，活動(dòng)度差，與皮膚緊密結(jié)合，證明模型復(fù)制成功，成功率為100%。康萊特注射后7 d，皮下移植瘤體積下降，相對(duì)于對(duì)照組，體積下降49%。

2.4 康萊特注射液對(duì)裸鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤DWI的影響

MRI的b值增加使兩組皮下移植瘤DWI的清晰程度逐漸降低，并出現(xiàn)圖像變形，同時(shí)腫瘤信號(hào)增加強(qiáng)度也不清晰，與周圍組織的邊界也逐漸模糊。康萊特注射液治療后引起腫瘤壞死區(qū)域變得模糊。在兩組ADC顯示圖表明，腫瘤呈低信號(hào)，邊界清晰；而康萊特注射液治療后7 d存在高信號(hào)斑點(diǎn)或片狀局部液性暗區(qū)。治療組DWI指標(biāo)與對(duì)照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表1 兩組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖率比較（n =10，%，±s）

表1 兩組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖率比較（n =10，%，±s）

圖1 兩組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖率比較（n =10，±s）

2.5 康萊特注射液抑制裸鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤血管的生成

治療后7 d，治療組、對(duì)照組的VEGF陽(yáng)性表達(dá)的率分別為43%和58%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.306，P=0.021）。治療組CD34染色陽(yáng)性的新生血管降低，僅在腫瘤的邊緣部分可見(jiàn)。兩組MVD計(jì)數(shù)、VEGF計(jì)分、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分比比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分比較對(duì)照組下降55%。見(jiàn)表4和圖 3、4。

2.6 MVD參數(shù)與DWI的相關(guān)性

治療后7 d，兩組ADCperf值與MVD呈正相關(guān)，ADC10b與 MVD 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表 5、6。

表2 兩組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡率比較（n =10，%，±s）

表2 兩組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡率比較（n =10，%，±s）

圖2 兩組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡率比較（n =10，%，±s）

表3 兩組治療后DWI指標(biāo)比較 （n =10，×10-3 mm2/s，±s）

表3 兩組治療后DWI指標(biāo)比較 （n =10，×10-3 mm2/s，±s）

對(duì)照組 0.234±0.026 0.044±0.005 0.141±0.013 0.030±0.004 0.101±0.006治療組 0.316±0.037 0.059±0.005 0.109±0.006 0.043±0.005 0.090±0.006 t值 4.968 6.869 5.327 9.345 5.821

表4 兩組治療后MVD計(jì)數(shù)、VEGF計(jì)分、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分比比較 （n =10，±s）

表4 兩組治療后MVD計(jì)數(shù)、VEGF計(jì)分、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分比比較 （n =10，±s）

對(duì)照組 11.701±2.524 4.432±1.074 91.234±8.227治療組 4.958±1.963 2.218±1.034 49.617±4.363 t值 4.957 6.122 10.284

圖3 抗腫瘤血管藥物治療前移植瘤組織CD34染色（免疫組織化學(xué)法×200）

圖4 抗腫瘤血管藥物治療后移植瘤組織CD34染色（免疫組織化學(xué)法×200）

表5 治療組DWI參數(shù)與MVD的相關(guān)性分析

表6 對(duì)照組DWI參數(shù)與MVD的相關(guān)性分析

3 討論

研究表明，DWI圖像可以反映早期腫瘤內(nèi)部變化及療效，在評(píng)估化學(xué)藥物治療腫瘤中具有很好的效果[9-10]。在未治療的結(jié)腸癌皮下移植瘤，ADCperf值與血流灌注緊密相關(guān)，隨著灌注量的增加，其不斷變大，因此可以反映血流的情況。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，康萊特注射液治療后，ADCperf值下降，這說(shuō)明中藥康萊特注射液可以有效降低結(jié)腸癌皮下瘤的血流灌注。同時(shí)本研究也結(jié)果證實(shí)，ADCperf值與MVD計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。ADChigh值主要與水分子的運(yùn)動(dòng)功能相關(guān)密切，因此ADChigh值越高，腫瘤內(nèi)部血流速度也越快，對(duì)營(yíng)養(yǎng)和氧氣的供給也越豐富。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，康萊特注射液治療后，ADChigh值下降，說(shuō)明中藥康萊特注射液可以降低腫瘤內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)和氧氣的供給，達(dá)到進(jìn)一步抑制腫瘤的目的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，ADChigh值與MVD計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，康萊特注射液治療后，VEGF計(jì)分與ADClow值呈正相關(guān)，其可能的原因是體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)康萊特注射液可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，水腫是凋亡的一種狀態(tài)，最終引起細(xì)胞內(nèi)水分子運(yùn)動(dòng)減少，即ADClow值的改變。PCNA計(jì)分與ADChigh呈負(fù)相關(guān)。因此，DWI參數(shù)特別是ADCperf值、ADC3b及ADC10b，可以作為評(píng)估中藥抗腫瘤療效的有效指標(biāo)，具有很強(qiáng)的臨床研究?jī)r(jià)值。

康萊特注射液能抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖，用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將具有很好的療效。康萊特能促進(jìn)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的凋亡，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均能達(dá)到很好的抑制皮下成瘤體生長(zhǎng)，以及抑制腫瘤血管生成的作用。

康萊特能抑制裸鼠的人結(jié)腸癌皮下移植瘤生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)其凋亡和抑制增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)的[11-12]。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，康萊特注射液治療能抑制新生血管生成和腫瘤細(xì)胞的增殖活力。DWI參數(shù)可以作為評(píng)估抗腫瘤中藥療效的有效手段，其中ADCperf值、ADC3b及ADC10b與康萊特注射液治療后的免疫組織化學(xué)結(jié)果有相關(guān)性，因此可以作為評(píng)估中藥抗腫瘤療效的有效指標(biāo)，具有很強(qiáng)的臨床應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值。

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