HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸病變中應用價值的探討

賀仁娟，趙 敏*

（1.山西醫科大學，山西 太原 030001；2.山西省婦幼保健院，山西 太原 030013）

宮頸癌是世界上第三常見的婦科惡性腫瘤[1]，其發生主要與高危型人乳頭瘤病毒（human paplilloma virus，HPV）持續感染密切相關。然而大部分高危型HPV感染多于首次發現后的6到12個月自然回歸陰性，多為一過性感染[2]。近些年來各種HPV 檢測方法層出不窮，廣泛用于宮頸癌的篩查中，但是HPV DNA檢測只能反映病毒存在，有研究指出HPV E6/E7 mRNA檢測還可以反映病毒基因的活性[3]，用于宮頸癌篩查的有效方法之一。本研究對高危型HPV感染患者行HPV E6/E7mRNA檢測，分析HPV E6/E7mRNA與宮頸病變的關系，探究其對宮頸癌篩查的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2016年11月至2017年11月就診于山西省婦幼保健院的高危型HPV感染婦女為104例，年齡28～66歲。入組標準：有正常性生活；就診的前3天內未接受過陰道沖洗、上藥等局部處理；3個月內未使用過性激素。排除標準：除外免疫疾患、內外科疾病；除外合并其他陰道炎癥。

1.2 分組

在知情同意的前提下，取所有患者宮頸脫落細胞行HPV E6/E7mRNA檢測及陰道鏡宮頸活檢。組織學病理診斷結果判讀分為慢性宮頸炎（宮頸炎組）、低度鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）（低級別組）以及高度鱗狀上皮內病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）（高級別組）。隨機選取30例患者同時對其宮頸脫落細胞及宮頸石蠟包埋組織標本進行HPV E6/E7mRNA檢測，編號分組，分為宮頸脫落細胞組和宮頸石蠟組織組。

1.3 方法

1.3.1 高危型HPV感染的檢測

暴露宮頸后，將宮頸刷于宮頸口慢慢搓動，順時針方向旋轉5周。拿出宮頸刷，放入取樣瓶內，待檢測。用HC-2法測宮頸脫落細胞的13種高危型HPV DNA；試劑盒于美國DIGENE公司購買，按說明書中的步驟進行檢測。

1.3.2 HPV E6/E7 mRNA檢測

針對14種高危型HPV E6/E7 mRNA，選用河南中美合資科蒂亞生物技術有限公司試劑，用核酸探針信號放大檢測技術即支鏈DNA技術，將樣本用特定裂解液裂解，然后經探針雜交與信號放大，即得到基因定量結果。①宮頸脫落細胞檢測：將宮頸刷于宮頸口輕輕搓動，順時針方向旋轉5周，取出宮頸刷，折斷刷柄，放入取樣瓶內待用；②宮頸石蠟包埋組織：所選患者陰道鏡檢查術后，石蠟包埋宮頸小塊組織活檢標本，子宮頸石蠟標本均40 μm厚連續切片，將切下的組織裝進1.5 mL離心管內，操作時對以上標本對應編號，嚴格按照試劑盒說明步驟進行操作。

1.3.3 病理性檢查

入組患者均行陰道鏡活檢，以病理診斷確診，分組。

1.4 統計學處理

采取SPSS 23.0統計學軟件對數據進行分析處理，計數資料以百分數（%）表示，采用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 研究對象一般情況

入選患者年齡在28～66歲（P=0.078）；孕次和流產次分別在0～5次和0～4次（P=0.174和P=0.820）；初孕年齡和初次性生活年齡在18～30歲和17～27歲（P=0.862和P=0.617）；組間差異均無統計學意義。

2.2 HPV E6/E7 mRNA檢測與病理結果比較

HPV E6/E7 mRNA檢測在以下各組的陽性率不全相等，差異有統計學意義（x2=11.636，P＜0.05）。再進行x2分割，以α'= 0.0125為界值，結果發現宮頸炎組、低級別組分別和高級別組比較，陽性率差異具有統計學意義（x2分割=9.32、8.98，P＜0.0125），宮頸炎組與低級別組差異無統計學意義（P＞0.0125）。隨著宮頸病變級別的升高，HPV E6/E7 mRNA陽性率增加，高級別組陽性率最高。見表1。

表1 HPV E6/E7 mRNA檢測與病理結果比較

2.3 兩種標本行HPV E6/E7 mRNA檢測結果比較

宮頸脫落細胞組HPV E6/E7 mRNA檢測（+）20例，檢出率為66.67%；宮頸石蠟包埋組織組HPV E6/E7 mRNA檢測（+）16例，檢出率為53.33%。宮頸脫落細胞、宮頸石蠟包埋組織兩種標本測定HPV E6/E7 mRNA結果比較，差異無統計學意義（x2=1.11，P=0.430）。見表2。

表2 兩種標本的HPV E6/E7 mRNA檢測結果

3 討 論

宮頸癌的發生主要與HPV的感染密切相關，是最常見的婦科惡性腫瘤之一。研究表明HPV感染非常普遍，超過90%的女性將在一生中經歷HPV感染，其中大部分為短暫性感染，90%的感染者兩年內會自發消除，不會造成任何宮頸病變[4]，只有極少數患者，在持續 HPV的感染下才進展為宮頸上皮內瘤變和宮頸癌。

人乳頭瘤病毒（HPV）是一種小型環狀的雙鏈DNA，持續HPV感染后，其會與宿主細胞發生整合，HPV病毒的兩條癌基因片段E6、E7轉錄、翻譯出E6、E7蛋白，E6蛋白與腫瘤抑制基因P53結合，促進P53退化，導致其功能障礙；E7蛋白與視網膜母細胞瘤蛋白質（Rb）結合，使Rb蛋白水解，刺激細胞周期失控，從而細胞進入無限繁殖的狀態，導致宮頸癌的發生[5]。HPVE6/E7癌基因可以誘導惡性轉化，檢測HPV E6/E7 mRNA更能反映癌基因的活性，因此我們可以利用HPV E6/E7 mRNA檢測來評估HPV陽性患者發展為宮頸癌的風險，識別暫時性感染，避免過度治療。

本實驗結果顯示，在3個組中高危HPV E6/E7 mRNA陽性率不全相等，宮頸炎組、低級別組分別與高級別組比較，陽性率差異均有統計學意義，宮頸炎組與低級別組差異無統計學意義。隨著宮頸病變級別的升高，HPV E6/E7 mRNA陽性率增加，高級別組陽性率最高。這一結果顯示：E6、E7癌基因可能促進宮頸病變的進展，與宮頸病變的嚴重程度關系密切。這與Castle等[6]的研究結果一致。

本研究收集同一患者的宮頸脫落細胞和陰道鏡活檢石蠟組織30例行HPV E6/E7 mRNA檢測，宮頸脫落細胞標本HPV E6/E7 mRNA檢出率為 66.7%，石蠟組織標本HPV E6/E7 mRNA檢出率為 56.7%。宮頸脫落細胞、宮頸石蠟包埋組織兩種標本測定HPV E6/E7 mRNA結果比較，差異無統計學意義。因此在進行宮頸癌篩查中，兩種標本都可以用來進行HPV E6/E7 mRNA檢測，宮頸脫落細胞可以無創取材，具有更好的操作性。

本研究中存在以下問題：3例石蠟標本結果陽性，而細胞學檢測陰性，可能與宮頸病變位于深層，或者宮頸表面病變細胞壞死有關。6例宮頸脫落細胞檢測陽性的患者，石蠟組織結果提示陰性，宮頸涂片采樣面積大，而宮頸活檢標本只是在特定的點取樣以及石蠟標本取材等原因均可以導致這一結果，確切的機制有待進一步研究。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA與宮頸癌前病變、宮頸癌之間的關系密切，其作為新一代宮頸癌篩查方法，目前仍有許多新的內容有待探索，需要進一步大樣本研究，以便更多的宮頸早期病變被及時發現。

[1] Park S, Eom K, Kim J, et al. MiR-9, miR-21, and miR-155 as potential biomarkers for HPV positive and negative cervical cancer[J]. BMC cancer, 2017, 17(1): 658.

[2] Cattani P, Siddu A, D'Onghia S, et al. RNA (E6 and E7) assays versus DNA (E6 and E7) assays for risk evaluation for women infected with human papillomavirus[J]. Journal of clinical microbiology, 2009, 47(7): 2136-2141.

[3] Fontecha N, Basaras M, Hernáez S, et al. Assessment of human papillomavirus E6/E7 oncogene expression as cervical disease biomarker[J]. BMC cancer, 2016, 16(1): 852.

[4] De Sanjosé S, Diaz M, Castellsagué X, et al. Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology: a meta-analysis[J]. The Lancet infectious diseases, 2007, 7(7): 453-459.

[5] Zhang W, Che Q, Tan H, et al. Marine Streptomyces sp. derived antimycin analogues suppress HeLa cells via depletion HPV E6/E7 mediated by ROS-dependent ubiquitin–proteasome system[J].Scientific Reports, 2017, 7: 42180.

[6] Castle P E, Dockter J, Giachetti C, et al. A cross-sectional study of a prototype carcinogenic human papillomavirus E6/E7 messenger RNA assay for detection of cervical precancer and cancer[J].Clinical Cancer Research, 2007, 13(9): 2599-2605.