煙草黑脛病拮抗細菌的篩選及其發酵條件優化

尹福強　劉銘　蔡藝梅

摘要：為獲得對煙草黑脛病有較強生防效果的拮抗細菌，從四川省涼山州5個縣（市）煙草種植田地采集10份土壤樣品，通過稀釋平板法分離得到112株細菌。采用平板對峙法獲得39株對煙草黑脛病病原菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）拮抗效果較好的細菌。選取拮抗效果最好的GC-38菌株進行進一步研究，結果顯示，菌株GC-38對煙草黑脛病病菌抑制率為81.81%，經鑒定菌株GC-38為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliauefaciens）。優化后得到其最佳發酵條件：碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨，pH值為9.0，溫度在30～35 ℃范圍內。可見，GC-38菌株對煙草黑脛病有明顯的拮抗作用，是具有較大開發潛能的生防菌株。

關鍵詞：煙草黑脛病；拮抗細菌；抑菌率；發酵條件；生物防治

中圖分類號： S435.72文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0096-03

煙草是我國重要的經濟作物之一，近年來，煙草黑脛病逐漸成為僅次于煙草病毒病的第二大煙草病害，每年造成的經濟損失平均均為1億元[1-2]。煙草黑脛病是由煙草疫霉（Phytophthora parasitica var. nicotianae）引發的經土壤傳播的真菌性病害，主要發生在煙草成株階段，在苗床期發生較少，煙草黑脛病常年發病率為10%～15%，嚴重時發病率高于80%，甚至絕收，給煙草生產帶來嚴重的威脅。

對煙草黑脛病的防治，目前主要集中在化學防治方面[3]。但化學防治可造成環境污染，且容易產生抗藥性[4]。相對于化學防治而言，生物防治具有成本低、有效期長、不污染環境、對人畜安全、病害不易產生抗性、可減少化學農藥用料、節約能源等優點。本研究從煙草根際土壤中分離篩選出有益細菌，篩選拮抗效果較好的菌株，然后對其進行鑒定，研究其生長曲線及發酵條件，為更好地利用該菌株奠定基礎，同時為黑脛病的生物防治提供資源。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試菌種

煙草疫霉（P.parasitica var. nicotianae），由西昌學院植物保護實驗室提供。

1.1.2供試土壤樣品

采自四川省涼山州會理縣、普格縣、鹽源縣、冕寧縣、西昌市5個縣（市）煙草黑脛病發病嚴重的健康煙草植株的根際土壤。

1.1.3供試培養基

PDA培養基、燕麥培養基、NA液體培養基，培養基配方均參照《微生物及其應用》[5]。

1.2試驗方法

1.2.1拮抗細菌的分離

采用稀釋平板法分離拮抗細菌。在健康煙草植株的根際采集土壤樣品，采用5點法取樣，每點取20 g土壤樣品，每塊煙田中共取100 g土壤樣品。5個縣（市）的取樣點共取10份土壤樣品，分別將每份土壤樣品充分混勻后稱取10 g裝入10個三角瓶中，并加入適量提前滅菌的玻璃珠和90 mL無菌水，將三角瓶振蕩20 min，靜置 5 min 后取其上清液。最后用無菌水將上清液稀釋成濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8懸浮液，本試驗取用10-6、10-7、10-8懸浮液，在超凈工作臺上用三角玻璃棒將上清液均勻涂抹于NA平板上，28 ℃ 恒溫培養1～2 d。待菌落長出后，將單菌落逐個挑出轉接于試管中，進行純化培養并編號。

1.2.2拮抗細菌的篩選

以煙草黑脛病病菌作為病原菌，采用對峙劃線法測定拮抗細菌對病原菌的拮抗作用，用直徑為 5 mm 的打孔器打取病原菌菌餅，接種于PDA平板中心，用接種環挑取供試拮抗細菌于距平板中央約3 cm處劃1條貫穿培養皿的菌線，以接種病原菌菌餅不接拮抗菌的PDA平板作為對照，在28 ℃恒溫培養，產生抑菌效果后，用游標卡尺測量菌落半徑，計算抑菌率。

抑菌率=（對照組病原菌菌落半徑-處理組病原菌菌落半徑）/對照組病原菌菌落半徑×100%。

選出對病原菌有拮抗效果的菌株，再以相同的方法進行復篩，每個菌株3次重復，從中選出拮抗效果最好的1株菌株，用于發酵條件的優化試驗。

1.2.3拮抗細菌的鑒定

采用劃線培養法將篩選出的拮抗效果最好的細菌菌株接種至NA平板上，35 ℃倒置培養1～2 d，通過細菌的形態特征及生理生化特征進行初步鑒定。鑒定方法參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》[6]和《常見細菌系統鑒定手冊》[7]。

1.2.4拮抗細菌菌株種子液制備

從篩選出的拮抗效果最好的細菌菌株斜面上挑取1環培養物接種于50 mL NA液體培養基中，于35 ℃、140 r/min振蕩培養12 h得到拮抗細菌種子液。

1.2.5生長曲線的測定

將細菌菌株種子液以4 mL的接種量接入250 mL的NA液體培養基中，35 ℃、140 r/min振蕩培養，分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48 h取出2 mL培養液測其D600 nm，繪制生長曲線。

1.2.6發酵條件優化

NA培養基中分別含有蛋白胨和葡萄糖，為使發酵條件得到優化可以在其他培養基配方不變的基礎上，分別用其他可用氮源、碳源將蛋白胨、葡萄糖換掉。本試驗能夠使用的氮源有硝酸銨、硝酸鉀、氯化銨和硝酸鈉，可使用的碳源有蔗糖、可溶性淀粉、乳糖和麥芽糖。通過對氮源、碳源的更換分別制成了不同氮源、碳源的培養基。改變溫度、pH值，以4 mL的接種量將種子液接入到250 mL不同培養基中，140 r/min振蕩培養，測其D600 nm，得到拮抗細菌的最適發酵條件。

2結果與分析endprint

2.1煙草黑脛病根際拮抗細菌的篩選

用稀釋平板法分離并得到了112株細菌，采用平板劃線對峙法分別接種病原菌和細菌。首先取5 mm病原菌菌餅接種于PDA平板中央，再用劃線法在距平板中心約3 cm處將細菌接種于平板上，28 ℃倒置培養6 d后觀察抑菌效果，計算抑菌率。由表1可知，有抑菌作用的菌株共39株，占3482%，這39株拮抗菌對病原菌的平均抑制率為64.57%，拮抗效果最好的菌株是GC-38，其抑菌率高達81.81%。

2.2菌株GC-38的鑒定

GC-38菌株在NA培養基上菌落為乳白色至淡黃色，菌落直徑2～3 mm，圓形，周圍不規則，表面不光滑，有皺紋。顯微鏡下觀察，菌體呈桿狀，直或接近直，（0.3～2.2） μm×（1.2～7.0） μm，多數運動，鞭毛典型側生。由表2可知，GC-38菌株的革蘭氏染色、葡萄糖、蔗糖、氧化酶、接觸酶、淀粉水解、硝酸鹽還原、甲基紅、伏-普反應（V-P）、明膠液化和檸檬酸鹽試驗結果均為陽性，而吲哚、乙醇氧化、乙酸試驗結果均為陰性。菌株GC-38的形態及生理生化特性與解淀粉芽孢桿菌最為接近，經鑒定，GC-38為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliauefaciens）。

2.3生長曲線的繪制

由圖1可知，GC-38菌株的生長曲線基本呈“S”形，0～12 h 其生長較為平緩，為延遲期；12～33 h菌株生長相對于 0～12 h要快很多，為對數生長期；在33～42 h菌株基本停止生長，為穩定期；42 h后菌株不再生長甚至出現死亡的現象，此時為衰亡期。該菌株在對數生長期生長迅速，代謝比較強，生命力強，最適合用作種子液，因此，選取12 h時的發酵液作為種子液。

2.4GC-38菌株發酵培養基的優化

2.4.1pH值對GC-38菌株生長的影響

將GC-38菌株的種子液按4 mL的接種量分別接種于初始pH值分別為6、7、8、9、10、11、12，裝液量為250 mL的發酵培養基中，于 140 r/min、35 ℃恒溫振蕩培養20 h，測定其D600 nm。由圖2可知，pH值為9時，GC-38菌株的D600 nm最高，即菌株生長量較大。因此，GC-38菌株發酵的最適pH值為9。

2.4.2溫度對GC-38菌株生長的影響

將GC-38菌株的種子液按4 mL的接種量接種到250 mL、pH值為9的基礎培養基中，分別在15、20、25、30、35、40、45 ℃條件下，140 r/min振蕩培養20 h，測定其D600 nm。由圖3可知，溫度為30～35 ℃時，GC-38菌株的生長量較大，因此，最適溫度范圍為30～35 ℃。

2.4.3碳源篩選

將GC-38菌株的種子液按4 mL的接種量接種到250 mL、pH值為9的碳源培養基中，140 r/min、35 ℃ 恒溫振蕩培養20 h，稀釋20倍測定其D600 nm。由圖4可知，以葡萄糖為碳源對GC-38菌株生長量的作用最大，因此，確定最適碳源為葡萄糖。

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2.4.4氮源篩選

將GC-38菌株的種子液按4 mL的接種量，接種到250 mL、pH值為9的氮源培養基中，140 r/min、35 ℃ 恒溫振蕩培養20 h，測定其D600 nm。由圖5可知，蛋白胨為氮源時菌株的D600 nm最高，即菌株生長量最大，因此，確定最適氮源為蛋白胨。

3討論

20世紀90年代以來，越來越多的人開始關注生物防治，用于生物防治的微生物有很多，主要包括真菌、細菌、放線菌、病毒等。易龍等從煙草病株提取出對煙草赤星病病菌有明顯抑制作用的拮抗內生細菌Ttb162[8]。劉鑫海等從甜瓜表面分離得到的假單胞菌對甜瓜枯萎病的生防效果較好[9]。唐圣華等從煙草根際土壤中分離得到的1株枯草芽孢桿菌對煙草赤星病有較好的防效[10]。

近年來，芽孢桿菌用于病害防治的研究較多，某些芽孢桿菌不僅能防病而且在防病的同時還能促進作物的生長，使作物的產量得到顯著的增加[11-12]。朱曉飛等從土壤中篩選出的解淀粉芽孢桿菌對水稻紋枯病的抑制率高于70%[13]。本研究篩選的GC-38解淀粉芽孢桿菌對煙草黑脛病具有較好的抑菌活性，這在此前還未見報道，但解淀粉芽孢桿菌對煙草黑脛病病原菌的抑制機理及大田防治效果還有待進一步研究。

參考文獻：

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