大花三色堇和角堇對低溫脅迫的生理響應及其抗寒性

齊陽陽　杜曉華　王夢葉

摘要：為探討大花三色堇和角堇響應低溫脅迫的生理特性，為我國低溫條件下大花三色堇和角堇的栽培及抗寒育種提供參考，以1個大花三色堇資源HAR和3個角堇資源JB、E01、08H為材料，分別在-5 ℃ 8 h、-5 ℃ 16 h、-5 ℃ 24 h、-10 ℃ 7 h、-10 ℃ 14 h條件下對其進行低溫脅迫處理，以20 ℃為對照，研究低溫脅迫下三色堇葉片的電解質外滲率、葉綠素熒光參數（Fv/Fm）值、脯氨酸和可溶性糖含量的變化。結果表明，4個三色堇材料的電解質外滲率大致隨低溫脅迫程度的增加極顯著升高，但增幅變化不同，大花三色堇HAR的電解質外滲率在-5 ℃處理16 h時出現急劇升高，而3個角堇品種JB、E01、08H則在-5 ℃處理24 h或-10 ℃處理7 h時迅速升高。4個三色堇材料葉片的Fv/Fm值在-5 ℃低溫處理24 h或-10 ℃處理7h時，與對照相比極顯著下降。4個三色堇品種葉片的脯氨酸、可溶性糖含量隨脅迫程度的增加均大致呈先升后降的趨勢。在低溫脅迫程度達到及輕于-5 ℃ 16 h時，大花三色堇與角堇的可溶性糖、脯氨酸含量呈逐漸增加趨勢；隨著低溫脅迫程度的加劇，可溶性糖、脯氨酸含量呈下降趨勢。對各材料在低溫脅迫下各項生理指標變化進行比較，推斷出三色堇抗寒性大小排序為E01>JB>08H>HAR。

關鍵詞：三色堇；細胞膜透性；可溶性糖；游離脯氨酸；葉綠素熒光

中圖分類號： S681.901文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0115-04

大花三色堇（Viola×wittrockiana）、角堇（Viola cornuta）為堇菜科堇菜屬多年生草本植物，起源于歐洲，常作一年生或二年生栽培。其園藝品種繁多，花色豐富，花期長，是春、秋季重要的花壇花卉，素有“花壇皇后”之美譽，在歐美國家十分流行[1-2]。我國自20世紀80年代將其引入北京、上海等大城市公園栽培，近年來大花三色堇在全國很多城市開始普遍應用。

低溫是限制植物區域性分布、季節性生長的重要環境因素之一。研究大花三色堇、角堇對低溫脅迫的生理響應及其適應能力，對于了解大花三色堇、角堇的適宜栽培區域和栽培季節具有重要的指導意義。羅玉蘭等曾研究了上海市自然低溫條件下當地三色堇（紫花地丁）與荷蘭引進三色堇的生理響應[3]，但該研究未能明確三色堇所能承受的具體低溫范圍及在不同程度低溫脅迫下的生理響應，對其他地區的三色堇抗寒栽培缺乏指導性。至于大花三色堇、角堇是否可抵御我國長江以北地區（如河南省）的冬季低溫，滿足圣誕節、元旦等節日的城鄉美化需要，或可承受北方秋冬季哪段時間的低溫，是需要解答的現實問題。

本研究以河南省豫北的新鄉市冬季1月份平均氣溫 -5 ℃、極端最低氣溫-10 ℃為參照[4]，分別設置-5、-10 ℃ 2個低溫溫度，并根據冬季氣溫的日變化情況，設置不同的低溫脅迫時間。以引自國內外不同地區的4份大花三色堇、角堇品種資源為試驗材料，通過人工模擬不同程度的低溫脅迫，研究低溫脅迫下三色堇細胞膜透性、可溶性糖含量、脯氨酸含量等生理指標的變化情況。此外，由于葉綠素熒光已成為逆境生理研究的光合探針[5]，而目前在大花三色堇、角堇的低溫脅迫中尚未見相關研究報道，因此本研究同時將葉綠素熒光參數（Fv/Fm）納入觀測指標。通過以上研究，以期探討大花三色堇、角堇響應低溫脅迫的生理特性，為我國寒冷季節或冷涼地區大花三色堇、角堇的栽培及其抗寒材料的選擇提供參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料為引自國內外不同地區的4份大花三色堇、角堇品種資源（表1）。種子由河南科技學院新鄉市草花育種重點實驗室提供。試驗材料于2014年10月播種于200孔穴盤中，長至2～3張真葉后移栽于10 cm×10 cm營養缽中，15～20 ℃培養，生長期采用常規管理。待苗長至7～10張葉時進行低溫脅迫處理。

1.2方法

1.2.1材料的處理各品種選擇長勢基本一致的植株，先在5 ℃下進行1周抗寒鍛煉，然后進行低溫脅迫處理。設5個低溫處理：-5 ℃ 8 h，-5 ℃ 16 h，-5 ℃ 24 h，-10 ℃ 7 h，-10 ℃ 14 h，以20 ℃為對照。脅迫處理后，分別測定植株葉片葉綠素熒光參數（Fv/Fm）、可溶性糖含量，游離脯氨酸含量及細胞膜透性。試驗設3次重復。

1.2.2生理指標測定葉綠素熒光參數（Fv/Fm）的測定采用YaXin-1611G葉綠素熒光儀進行。用葉夾夾住第3～5張葉，暗適應20 min，在光化光強度為2 500 μmol/（m2·s）、持續時間10 s條件下測量得到葉綠素熒光參數（Fv/Fm）。

細胞膜透性測定采用電導法[6]進行。具體方法：取低溫脅迫的植物葉片，自來水洗凈后用蒸餾水沖洗3次，再用濾紙吸干表面，然后將葉片剪成適宜長度的長條（避開主脈），快速稱取鮮樣3份，每份0.1 g，分別置于10 mL盛有去離子水的刻度試管中，蓋上玻璃塞后置于室溫下浸泡處理12 h，用DDS-307電導儀測定蒸餾水電導率（S0）、浸提液電導率（S1），然后沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測定浸提液電導率（S2）。相對電導率計算公式：

[JZ]相對電導率=（S1-S0）/（S2-S0）×100%。

可溶性糖含量的測定采用蒽酮法[6]，游離脯氨酸含量用茚三酮法測定[6]。以上指標均重復測定3次。

1.2.3數據處理采用Excel 2003、DPSv3.01軟件分析試驗數據，利用Duncans多重比較法進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1大花三色堇和角堇在低溫脅迫下的葉片細胞膜透性變化

低溫脅迫常造成植物細胞質膜損傷，導致溶質泄漏，因此常用電解質外滲率評價膜結構受損情況[7]。由圖1、表2可見，在對照溫度下，4份試驗材料的電解質外滲率（相對電導率）無顯著差異。在-5 ℃低溫脅迫8 h時，角堇JB、08H及大花三色堇HAR的電解質外滲率與其對照（20 ℃）相比表現出提高，達極顯著水平，說明后三者的葉片開始出現凍害；而角堇E01的電解質外滲率與其對照相比無極顯著差異，且其電解質外滲率顯著低于HAR，說明其抗寒性較強。當 -5 ℃ 處理延長至16 h時，角堇E01的電解質外滲率與其對照存在極顯著差異，說明其葉片開始受凍；角堇JB、08H的電解質外滲率繼續緩慢增加；大花三色堇HAR的電解質外滲率則迅速提高，達到37.48%，達到其對照的4.34倍，顯著高于3份角堇品種，表明其葉片已出現嚴重凍害，最不抗寒。當-5 ℃處理延長至24 h時，角堇JB、E01、08H的電解質外滲率均急劇提高，分別達到34.12%、30.13%、36.78%，分別為對照的433、3.70、4.47倍，表明3份角堇材料已出現嚴重凍害，各品種電解質外滲率與對照相比存在極顯著差異，排序依次為E01

2.2大花三色堇和角堇在低溫脅迫下葉片脯氨酸含量的變化

脯氨酸是參與植物細胞抗寒的主要滲透調節物質之一，能夠提高細胞液濃度、降低水勢、增加細胞的保水能力，從而降低冰點，增強植物忍受一定程度的低溫脅迫能力[8]。從圖2可以看出，隨著低溫脅迫程度的加重，4份試驗材料（JB、E01、08H、HAR）的游離脯氨酸含量呈現先上升后下降的變化趨勢，在-5 ℃ 16 h處理下達到最大值，4個品種分別比對照增加了87%、60%、64%、40%；之后，隨著低溫脅迫程度加重，脯氨酸含量逐漸降低，至-10 ℃ 14 h處理下，3個角堇品種葉片的脯氨酸含量降至對照水平，而大花三色堇HAR的脯氨酸含量低于對照。

在同一處理條件下，不同品種葉片脯氨酸含量的比較表明，大花三色堇HAR在常溫下的脯氨酸含量與3份角堇品種無顯著差異，但在-5 ℃ 8 h、-5 ℃ 16 h低溫條件下，顯著低于3份角堇品種；3份角堇品種的葉片脯氨酸含量以08H最高，E01次之，JB較低（圖2、表2），表明大花三色堇HAR通過脯氨酸含量變化的調滲能力明顯低于其他3個角堇品種，在3份角堇品種中，角堇08H通過脯氨酸含量變化的調滲能力最強。

2.3大花三色堇和角堇在低溫脅迫下葉片可溶性糖含量的變化

可溶性糖也是植物細胞的主要調滲物質之一，在一定的低溫脅迫條件下，其含量的增加可提高植物的抗寒能力[9]。由圖3、表2可知，在低溫脅迫下，隨著脅迫程度的加劇，4份三色堇試驗材料（JB、E01、08H、HAR）的可溶性糖含量變化整體呈先上升后下降的變化趨勢，角堇JB在-5 ℃ 8 h、-5 ℃ 16 h時達到最大值，分別比對照提高了45%、44%；角堇E01、08H、大花三色堇HAR在-5 ℃處理16 h時達到最大值，分別比對照提高了 159%、210%、74%；之后，隨著低溫脅迫程度加重，在-5 ℃ 24 h、-10 ℃ 7 h、-10 ℃ 14 h時，各品種的葉片可溶性糖含量極顯著降低，至-10 ℃ 14 h處理時，4個品種的葉片可溶性糖含量降至接近對照水平。

在同一脅迫條件下，不同品種葉片可溶性糖含量的比較表明，-5 ℃ 16 h條件下，4個品種的可溶性糖含量差異顯著，其中08H可溶性糖含量最高，與對照相比增幅最大，說明它通過可溶性糖含量變化的抗寒調滲能力最強；而大花三色堇HAR的可溶性糖含量顯著低于3個角堇品種，僅比對照增加74%，說明它通過可溶性糖含量的變化進行抗寒調滲的能力較差（表2）。

2.4低溫脅迫對三色堇葉片Fv/Fm的影響

Fv/Fm是PSⅡ光化學反應狀況的重要熒光動力學參數，顯示PSⅡ的最大潛在光合能力，可反映PSⅡ反應中心內原初光能的轉化效率。在低溫脅迫下，植物葉綠體膜受損，原初光能轉化率下降[5]。抗寒能力強的品種其Fv/Fm下降較慢，因此該指標可作為鑒定植物抗寒能力大小的指標。由圖4可知，在-5 ℃ 8 h、-5 ℃ 16 h條件下，4個品種葉片的Fv/Fm值與對照相比差異未達極顯著水平，說明當低溫脅迫程度輕于 -5 ℃ 16 h時，PSⅡ反應中心原初光能轉化率并未出現明顯下降。但當-5 ℃低溫延長至24 h時或-10 ℃處理7 h時，4個品種葉片的Fv/Fm值與對照相比極顯著下降，表明大花三色堇與角堇的PSⅡ反應中心受到損傷，導致光合能力降低。至-10 ℃ 14 h時，角堇JB、E01、08H和大花三色堇HAR的Fv/Fm值分別比對照分別下降了28.5%、48.2%、66.6%、64.5%，此時大花三色堇HAR、角堇08H的Fv/Fm值顯著低于角堇JB，與對照相比下降幅度也最大，說明HAR、08H的光合器官的抗寒性較差。

3討論

3.1大花三色堇與角堇可忍受的低溫脅迫范圍

植物在受到低溫危害時，細胞的質膜透性增大，電解質外滲，因此電解質外滲率越高，說明細胞膜受傷程度越重[6]。本研究表明，隨著低溫脅迫程度的加劇，大花三色堇與角堇的電解質外滲率呈現先緩慢提高，后急劇提高，再緩慢提高的趨勢，這與其他植物的研究相一致。大花三色堇HAR在-5 ℃ 16 h的低溫脅迫下，電解質外滲率出現迅速提高。而3個角堇品種是在-5 ℃ 24 h或-10 ℃ 7 h時迅速提高，因此，-5 ℃ 16 h可能是大花三色堇HAR的葉片出現嚴重冷害的低溫臨界點，而-5 ℃ 24 h或-10 ℃ 7 h可能是角堇葉片出現嚴重冷害的低溫臨界點。低于-5 ℃ 16 h的低溫脅迫條件下，大花三色堇、角堇可能不會出現嚴重凍害。這與筆者多年來在河南新鄉地區的觀測基本一致。在該地區，冬季的冷棚足可以保證大花三色堇種質資源安全越冬，葉片無明顯凍害癥狀，翌年春季正常開花。

在低溫脅迫下，植物葉綠體膜受傷，導致光合光能轉化效率下降，釋放的熒光量增加，光合速率下降。葉綠素熒光參數（Fv/Fm）是PSⅡ光化學反應狀況的熒光動力學參數，表征 PSⅡ 的最大潛在光合能力，反映PSⅡ反應中心內原初光能的轉化效率[5，10]。Fv/Fm值下降，說明植物光合器官受損。在 -5 ℃ 低溫處理24 h時或-10 ℃處理7 h時，4個品種葉片的Fv/Fm值與對照相比極顯著下降，表明大花三色堇與角堇的PSⅡ反應中心會受到損傷，光合能力降低。由此說明，葉綠素熒光參數顯著下降時，植物葉片已嚴重受害，與質膜透性研究結果基本接近，且該指標測定無損、快速，因此可以作為植物寒害測定與資源抗寒性評價指標的首選。

3.2低溫脅迫下大花三色堇和角堇的生理響應及其抗寒性

可溶性糖、脯氨酸是植物主要的滲透調節物質，能夠提高細胞液濃度，降低水勢，增加細胞的保水能力，從而降低冰點，增強植物忍受一定程度的低溫脅迫能力[8]。對許多植物的研究表明，在一定程度的低溫脅迫下，植物可通過增加其體內的可溶性糖、脯氨酸含量提高抵御寒害的能力[11-13]。本研究結果與其一致，在低溫脅迫程度達到及輕于-5 ℃ 16 h時，大花三色堇與角堇的可溶性糖、脯氨酸含量呈逐漸增加趨勢。隨著低溫脅迫程度的加劇，大花三色堇與角堇的可溶性糖、脯氨酸含量呈下降趨勢。這與茶樹、油棕的研究結果相一致[14-15]。有關可溶性糖含量的降低，可能是低溫脅迫下植物體內的無氧呼吸增加，能量消耗增大，隨著低溫脅迫持續或加重，最終導致可溶性糖含量降低[11]。關于脯氨酸含量的變化，不同研究結果不一致，在一些植物上的研究表明，隨著低溫脅迫加重，脯氨酸含量上升并維持在較高水平，是蛋白質降解的結果[7-8，11]。但在另一些植物上的研究表明，當低溫脅迫加重到一定程度時，脯氨酸含量開始下降，導致這一結果的原因可能是植物體內防御機制被破壞，使可溶性糖、脯氨酸含量下降[16-17]。endprint

抗寒性較強的植物品種在相同的低溫脅迫條件下其質膜受損越輕，電導率越低，反之電導率越大，但變化情況因品種不同而異，HAR是在-5 ℃ 16 h的低溫脅迫下，電解質外滲率出現迅速增加，說明其抗寒性比3個角堇品種差。由于在-5 ℃ 8 h脅迫條件下，E01未出現明顯電解質外滲現象，而其他2個角堇品種均出現了較明顯的電解質外滲，說明E01的抗寒性較強。在低溫脅迫下，JB的電解質外滲率始終低于08H，說明JB的抗寒性要強于08H，因此，4份材料的抗寒性大小依次為E01>JB>08H>HAR。本研究顯示，不同植物抗寒性的提升途徑可能不同，有些通過增加脯氨酸含量，有些通過增加可溶性糖含量，有些可能通過抗氧化酶活性的提高減輕低溫引起的傷害等。因此，對于不同的植物材料應作具體分析。

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