4環HMW—PAHs降解菌的篩選、鑒定及降解特性

張雪娜　賈海濱　張麗秀

摘要：利用富集培養法從河北省典型煤礦區土壤中分離到1株4環高環芳烴（HMW-PAHs）降解菌，經形態特征觀察和18S rRNA序列分析確定該菌株為鐮刀菌屬（Fusarium sp.），命名為Y15。通過室內搖瓶和土壤培養試驗，研究了其對4環HMW-PAHs的降解性能。結果表明，室內搖瓶培養7 d后，Y15接種量為100 mL/L時，對初始濃度為 10 mg/L 的芘（Pyr）、苯并[a]蒽（BaA）、[XCZ60.tif]（Chry）的降解效率分別為52.94%、32.14%、33.93%。其中，對Pyr的降解率隨初始濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，在40 mg/L時降解率最高，為69.67%。Y15接種在PAHs污染的土壤中，經30 d培養試驗，Y15對3種高環芳烴Pyr、BaA、Chry的總降解率為13.15%。在3種PAHs中，Y15對Pry的降解率顯著高于對BaA、Chry的降解率（P<0.05）。從土壤酶活性變化規律看，與添加滅活菌液的對照組相比，添加菌液處理的土壤多酚氧化酶和過氧化物酶活性明顯降低。綜上所述，該菌株是1株能以4環HMW-PAHs為唯一碳源且具有高效降解功能的潛在降解菌。

關鍵詞：芘；苯并蒽；[XCZ60.tif]；生物降解；鐮刀菌

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0282-04

多環芳烴 （polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指由2個或2個以上苯環以角狀、線狀或簇狀組成的一類持久性有機污染物，在環境中普遍存在，因具有致畸、致癌、致突變的性質而受到人們的重視[1-2]。其中，4環及4環以上的高環PAHs（HMW-PAHs），因其疏水性、親脂性、穩定性更強，更不易被降解[3-4]，對自然環境和人體健康均造成極大威脅，其中，4環PAHs 中的芘（Pyr）、[XCZ60.tif]（Chry）、苯并[a]蒽（BaA）屬于美國環境保護局列入優先控制污染中的16種PAHs。

目前，微生物修復是去除環境中PAHs的主要方式，微生物系統、多環芳烴污染物的類型、污染區域的地質化學條件是解決PAHs污染問題的3個重要條件，在已知污染物類型和污染區域條件的基礎上，微生物系統成為PAHs生物降解的主導者[5]。從污染土壤中篩選高效降解菌是開展微生物修復的基礎。白鵬等從石油污染區土壤分離篩選得到1株芘高效降解菌菌株，菌株ZQ5在30 ℃振蕩培養16 d后對 150 mg/L 芘的降解率為90.31%[6]。李曉明等從焦化廠土壤中篩選出芘降解菌群，還有少量菌種篩選自海洋沉積物或污泥[7]，因此，在不同的典型污染土壤中進行篩菌工作對補充菌種資源庫及修復特定環境下的PAHs污染問題尤為重要。目前為止，從煤礦區受PAHs長期污染的農田土壤中篩選降解菌株的工作尚未開展，可加強研究。同時，近年來，國內外對高分子量PAHs的微生物降解研究較少，而能夠以高分子量PAHs為唯一碳源的微生物資源更少[8]。

因此，本研究擬通過富集培養，從典型煤礦區多環芳烴長期污染土壤中篩選高分子量PAHs的高效降解菌，通過形態學觀察和18S rRNA序列分子生物學分析，對菌種進行鑒定，并通過室內搖瓶培養試驗和室內土壤培養試驗考察其對Pyr、BaA、Chry的降解能力，為微生物修復4環HMW-PAHs的環境提供資源保障和理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試菌株為筆者課題組前期富集、篩選、馴化、待鑒定的菌株。

供試土壤采自河北省典型煤礦區的農田污染場地，區內分布有焦化廠和鋼鐵廠等生產企業，土壤樣品為受PAHs長期污染的老化土壤，Pyr、BaA、Chry的總含量達2 019.23 mg/kg。取 0～10 cm表層污染土壤，遮光風干后，過1 mm篩，混合均勻后，在4 ℃的冰箱內保存備用，其基本化學性質如表1所示。供試土壤樣品的pH值為7.46。

多環芳烴芘（Pyr）、苯并[a]蒽（BaA）、[XCZ60.tif]（Chry），均為分析純。

無機鹽液體培養基：0.20 g MgSO4·7H2O、0.02 g CaCl2·2H2O、0.01 g FeSO4·7H2O、0.40 g KH2PO4、0.60 g Na2HPO4、0.02 g MnSO4·H2O、1.00 g NH4NO3、1.00 L蒸餾水（無機鹽固體培養基在無機鹽液體培養基的基礎上加入 15～20 g瓊脂）。

高氏一號固體培養基：2.000 g可溶性淀粉、0.050 g氯化鈉、0.110 g硝酸鉀、0.050 g磷酸氫二鉀、0.050 g硫酸鎂、0001 g硫酸亞鐵、1.500～2.000 g瓊脂、100 mL蒸餾水，pH值為7.4～7.6（高氏一號液體培養基在高氏一號固體培養基的基礎上去掉瓊脂）。

1.24環HMW-PAHs降解菌的篩選

富集：于100 mL已滅菌的無機鹽液體培養基中放入5 g農田污染場地新鮮的土壤樣品，150 r/min、30 ℃振蕩培養 24 h 獲得富集菌液，取1 mL富集菌液接種到高氏一號培養基中進行培養。

篩選與純化：將上述在高氏一號培養基中培養后的富集菌液經含PAHs的無機鹽培養基進行篩選，并經多次轉接純化后獲得多株純化菌株。

馴化：將已篩選出的所有純菌接種到表層含120 μg 4環PAHs的無機鹽固體培養基中進行沖擊，30 ℃下培養7 d后觀察菌落生長狀況，得到目標降解菌株，將所述目標降解菌株接種到表層含12、24、48 μg 4環HMW-PAHs的無機鹽固體培養基中進行逐級馴化，30 ℃下恒溫培養7 d后，生長良好，將馴化后的菌株進行鑒定，并用甘油冷凍保存于-70 ℃冰箱，備用。endprint

1.34環HMW-PAHs降解菌的鑒定

1.3.1形態觀察及鑒定

將已充分活化的菌株接種到高氏一號固體培養基中，30 ℃培養48 h后觀察菌落，并在高倍顯微鏡下觀察菌株孢子、菌絲的形態學特征。

1.3.2菌株的分子生物學鑒定

以菌株基因組DNA為模板，用真菌核糖體rRNA區通用引物（ITS1、ITS4）進行18S rRNA擴增，PCR產物進行電泳檢測，將擴增片段回收、測序，根據18S rRNA的測序結果，利用Blast軟件在GenBank中與其他已測定的標準菌株的18S rRNA序列進行同源性比較。

1.4菌株對無機鹽液體培養基中Pyr、BaA、Chry 的降解特性

1.4.1菌懸液制備

取1 mL馴化后保存的菌液，接種于高氏一號固體培養基中，30 ℃，150 r/min振蕩培養7 d后得到目標菌株，將其接種于100 mL高氏一號液體培養基中，同樣條件培養48 h后得到富集菌液。

1.4.2菌株對Pyr、BaA、Chry的降解試驗設計

在100 mL三角瓶中加入18 mL無機鹽溶液滅菌后，添加一定量4環PAHs單體母液，待丙酮揮發后，接入10%的富集菌液，使PAHs單體Pyr、BaA、Chry的終濃度均為10 mg/L，以不添加富集菌液的處理作為對照組，均在150 r/min、30 ℃搖床中遮光振蕩培養7 d，每個處理設置3個重復。試驗方案如表2所示。

1.6樣品測定指標及方法[HJ1.45mm]

土壤基本理化性質：采用土壤農化常規分析法[9]測定。

PAHs無機鹽溶液測定指標：Pyr、BaA、Chry測定方法參照文獻[10-12]。在三角瓶中加入20 mL色譜純正己烷，超聲提取5 min后，使粘在壁上的PAHs全部浸到正己烷溶液中，再將三角瓶置于250 r/min振蕩器中，振蕩提取40 min后，再次超聲提取5 min，靜置分層后吸取1 mL上層正己烷溶液轉移至2 mL頂空進樣瓶中，待測。

土壤中HMW-PAHs測定指標及其分析方法：土壤中PAHs含量以風干質量計量，稱取20 g土壤樣品及10 g無水硫酸鈉，混合均勻后，加入20 μL替代物（濃度為20 μg/mL的氘代三聯苯與4-溴-2氟聯苯的正己烷溶液），用丙酮與正己烷體積比為1 ∶1的提取劑索氏提取12 h，并經過干燥、濃縮、凈化、再次濃縮后用正己烷定容至1 mL，待測[12-13]。

土壤酶活性測定指標及其分析方法：土壤多酚氧化酶活性采用鄰苯三酚比色法測定，以1 g風干土壤樣品2 h內生成的紫色沒食子素的毫克數表示；土壤過氧化物酶活性測定與多酚氧化酶活性的測定方法相同[14]。

儀器：氣相色譜儀-質譜儀聯用，氣相色譜儀為安捷倫6890，質譜儀為美國HP5972系列。

質量控制：回收率和檢測線的測定參考EPA標準方法，回收率測定采用土壤基質加標法[15]。

1.7數據統計分析

無機鹽溶液中多環芳烴降解率=（對照組PAHs含量-試驗組PAHs含量）/對照組PAHs含量×100%。

土壤中HMW-PAHs的降解率Rs=（C0-Ct）/C0×100%。其中，C0為對照組土壤中HMW-PAHs的含量，Ct為試驗組土壤中HMW-PAHs的含量。

試驗數據采用Excel 2003和SPSS 17.0進行統計分析。

2結果與分析

2.14環HMW-PAHs降解菌株的形態鑒定與18S rRNA分子生物學鑒定

菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）上30 ℃培養 48 h 后，培養基無色，菌絲生長密致，菌落的表面棉絮狀；分生孢子呈鐮刀形，分生孢子座為淺紫色，0～3個分隔，多數無隔。

對菌株的18S rRNA進行PCR擴增，經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得大小約500 bp的產物，擴增產物回收后進行測序，得到18S rRNA的序列為526 bp（圖1）。利用Blast軟件在GenBank中與其他標準菌株的18S rRNA序列進行同源性比較，該菌株18S rRNA序列與鐮刀菌屬真菌的18S rRNA序列相似性高達99%。結合菌株的形態特征分析與18S rRNA的結果，鑒定此菌株為鐮刀菌屬（Fusarium sp.），命名為Y15。

2.2Y15菌株對無機鹽培養液中Pyr、 BaA、Chry的降解特性

將Y15菌液加入分別含有10 mg/L Pyr、 BaA、Chry的無機鹽液體培養基中，7 d后測定Y15對3種HMW-PAHs的降解效果。由圖2可知，Y15菌液對Pyr、 BaA、Chry的降解率分別為5294%、32.14%、33.93%。經檢驗，Y15菌液對Pyr的降解率顯著高于對BaA、Chry的降解率（P<0.05），說明Y15菌株能夠分別以Pyr、BaA、Chry為唯一碳源和能源進行代謝繁殖。

由圖3可知，隨著Pyr初始濃度的升高，Y15菌株對Pyr的降解率呈現先升高后降低的趨勢，當Pyr的濃度為40 mg/L時降解效果較好，降解率高達69.67%，顯著高于對其余兩者的降解率（P<0.05），分別是其余兩者的1.32、2.01倍。由此可見，Y15菌株對高濃度的HMW-PAHs有較強的耐受能力。

2.3Y15菌株對老化污染土壤中Pyr、 BaA、Chry的降解效果

由圖4可知，添加Y15菌液的處理中Pyr、 BaA、Chry分別降低了15.02%、11.50%、12.20%，Y15菌株對4環 HMW-PAHs的總降解率達到了13.15%。根據單體去除效果可知，Y15對土壤中Pyr的降解效果顯著好于對BaA、Chry的降解效果（P<0.05），這說明Y15菌液對老化污染土壤中Pyr、 BaA、Chry均有一定的降解能力，且對Pyr的降解能力較強。endprint

2.4不同處理下土壤酶活性的顯著性分析

由表5可知，與對照相比，加入Y15菌液后，土壤多酚氧化酶活性、過氧化物酶活性顯著降低。對照處理土壤多酚氧化酶活性是施加Y15菌液處理中多酚氧化酶活性的1.62倍，與對照組處理相比，施加Y15菌液處理組過氧化物酶活性降低了23.83%。

3結論與討論

經過對典型煤礦區土壤中多環芳烴含量的檢測，證明土壤已經受到高濃度多環芳烴的嚴重污染[16]。在本研究中，在典型煤礦區土壤中分離到1株可分別以Pyr、 BaA、Chry為唯一碳源和能源的降解菌Y15菌株，經形態觀察和18S rRNA分子生物學分析，初步鑒定其屬于鐮刀菌屬。該菌株能夠利用、降解多種HWM-PAHs。目前，能夠降解HMW-PAHs的菌株一般多為細菌[17-21]，真菌中對白腐真菌研究最多[22-24]，對鐮刀菌屬降解HMW-PAHs的研究也僅見零星報道[25]。

在本研究搖瓶培養試驗中，7 d后Y15菌液對初始濃度為10 mg/L的Pyr、 BaA、Chry降解率達52.94%、32.14%、33.93%。而Ortega-González等以50 mg/L的Pyr為唯一碳源，14 d后，鐮刀菌屬對Pyr的降解率為51.32%[25]；絲狀真菌宛氏擬青霉30 d對BaA的單一體系的降解率為1718%[26]。這可能是由于菌株篩選地點不同其降解PAHs的能力存在差異，也可能是由搖瓶試驗培養的環境、時間不同所致。從煤礦區土壤篩選的鐮刀菌屬Y15菌株是一種優良的4環HMW-PAHs降解菌，對4環HMW-PAHs具有很好的降解潛力。此外，Y15對較高濃度及較低濃度的Pyr均有一定的降解效果，但是降解效果顯著低于最適降解濃度（P<0.05），這與其他學者的研究結果[6，27-28]一致。可能是由于Y15將Pyr作為唯一碳源，Pyr濃度過低則菌體對底物的競爭作用會影響其生長，或者是 PAHs濃度低時不能快速誘導產生裂解酶[27]；而過高濃度的Pyr以及Pyr代謝的中間產物的累積可能對降解菌起到了一定的毒害作用[6，28]，抑制了Y15的生長。

土壤培養試驗中，通過向滅菌老化污染土壤的土壤樣品中添加鐮刀菌屬Y15菌株的菌液以提高 PAHs 的降解效率，Y15菌液對Pyr、 BaA、Chry降解率分別為15.02%、1150%、12.20%，對4環PAHs的降解率為13.15%。Potin等將鐮刀菌屬等降解菌加入到未滅菌老化土壤中，30 d后，鐮刀菌屬對4環PAHs的降解率為22%[29]，這可能是由土壤的理化性質、菌種、接菌量不同所致[30]，也可能是因為鐮刀菌菌液中營養物質加入未滅菌土壤中影響了土著微生物的生長，促進其生長，提高PAHs的降解效果[31]。就土壤酶活性而言，多酚氧化酶活性與對照組相比顯著降低（P<0.05），與Liu等的結論[32]一致。

參考文獻：

[1]許麗，高振，羅霂，等. 一株高效降解芘的細菌分離、鑒定及其降解效果[J]. 微生物學報，2011，51（3）：313-319.

[2]Luan T G，Yu K S，Zhong Y，et al. Study of metabolites from the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） by bacterial consortium enriched from mangrove sediments[J]. Chemosphere，2006，65（11）：2289-2296.

[3]Shree N S，Rudra D T. Environmental bioremediation technologies[M]. Berlin：Springer，2007：409-443.

[4]羅霂. 高效降解高分子量多環芳烴混合菌劑的開發[D]. 北京：輕工業環境保護研究所，2013.

[5]Khanna P，Goyal D，Khanna S. Pyrene degradation by isolated from crude oil contaminated soil[J]. Polycyclic Aromatic Compounds，2011，31（1）：1-15.

[6]白鵬，鐘鳴，趙媛媛，等. 芘高效降解菌ZQ5的培養條件及無機元素對其降解效率的影響[J]. 環境工程學報，2012，6（7）：2411-2416.

[7]李曉明，張明江，金京華，等. 芘降解菌群馴化過程中的演變[J]. 微生物學報，2012，52（10）：1260-1267.

[8]Mohan S V，Kisa T，Ohkuma T，et al. Bioremediation technologies for treatment of PAH-contaminated soil and strategies to enhance process efficiency[J]. Reviews in Environmental Science and Biotechnology，2006，5（4）：347-374.

[9]鮑士旦. 土壤農化分析[M]. 北京：中國農業出版社，2000：30-163.

[10]曾躍春，李秋玲，高彥征，等. 叢枝菌根作用下土壤中多環芳烴的殘留及形態研究[J]. 土壤，2010，42（1）：106-110.

[11]賈寶亮，范丙全，隋新華，等. 分枝桿菌TZh51菌株的分離鑒定及其生物修復污染土壤的特性[J]. 微生物學報，2008，48（9）：1214-1220.

[12]劉金巍，安彩秀，王磊，等. 氣相色譜-質譜聯用法測定土壤中16 種多環芳烴[J]. 巖礦測試，2012，31（2）：325-330.endprint

[13]張志遠，王翠蘋，劉海濱. 可可毛色二孢菌對焦化廠土壤多環芳烴污染修復[J]. 環境科學，2012，33（8）：2832-2839.

[14]常瑞雪.污泥多環芳烴的植物修復效果及其影響機理研究[D]. 保定：河北農業大學，2013.

[15]United States Environmental Protection Agency. Semivolatile organic compounds by gas chromatography-mass spectrometry：8270D[S]. United States Environmental Protection Agency，1998

[15]趙歐亞，馮圣東，石維，等. 煤礦區農田土壤多環芳烴生態風險評估方法比較[J]. 安全與環境學報，2015，15（2）：352-358.

[16]García-Díaz C，Ponce-Noyola M T，Esparza-García F，et al. PAH removal of high molecular weight by characterized bacterial strains from different organic sources[J]. International Biodeterioration&Biodegradation，2013，85（7）：311-322.

[17]牛志剛，王新新，吳亮，等. 一株含油污泥多環芳烴降解菌的分離鑒定和降解特性[J]. 資源節約與環保，2015（3）：95-96，103.

[18]Caldini G，Cenci G，Manenti R，et al. The ability of an environmental isolate of Pseudomonas fluorescens，to utilize chrysene and other four-ring polynuclear aromatic hydrocarbons[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，1995，44（1）：225-229.

[19]楊璐溪. 新鞘氨醇桿菌US6-1降解HMW-PAHs的代謝路徑和轉錄調控研究[D]. 廈門：廈門大學，2014.

[20]Guo C，Ke L，Dang Z，et al. Temporal changes in Sphingomonas and Mycobacterium populations in mangrove sediments contaminated with different concentrations of polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs）[J]. Marine Pollution Bulletin，2011，62（1）：133-139.

[21]李烜楨，林先貴. 白腐真菌修復多環芳烴污染土壤及其降解機理的研究進展[J]. 安全與環境學報，2009，9（6）：71-76.

[22]Wen J W，Dawen G，Bo Z，et al. Co-metabolic degradation of pyrene by indigenous white-rot fungus Pseudotrametes gibbosa from the Northeast China[J]. International Biodeterioration & Biodegradation，2011，65（4）：600-604.

[23]Acevedo F，Pizzul L，Castillo M D，et al. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by the Chilean white-rot fungus Anthracophyllum discolor[J]. Journal of Hazardous Materials，2011，185（1）：212-219.

[24]Hidayat A，Tachibana S，Itoh K. Determination of chrysene degradation under saline conditions by Fusarium sp. F092，a fungus screened from nature[J]. Fungal Biology，2012，116（6）：706-714.

[25]Ortega-González D K，Cristiani-Urbina E，Flores-Ortíz C M，et al. Evaluation of the removal of pyrene and fluoranthene by Ochrobactrum anthropi，Fusarium sp. and their coculture[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2015，175（2）：1123-1138.

[26]李慧，蔡信德，羅琳，等. 一株可同時降解多種高環PAHs的絲狀真菌——宛氏擬青霉[J]. 生態學雜志. 2009，28（9）：1842-1846.

[27]Bouchez M，Blanchet D，Vandecasteele J P. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by pure strains and by defined strain associations：inhibition phenomena and cometabolism[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，1995，43（1）：156-164.

[28]崔赫. 一株多環芳烴降解菌的篩選，鑒定及其降解特性研究[D]. 長春：吉林農業大學，2013.

[29]Potin O，Rafin C，Veignie E. Bioremediation of an aged polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs）-contaminated soil by filamentous fungi isolated from the soil[J]. International Biodeterioration & Biodegradation，2004，54（1）：45-52.

[30]陳春云，岳珂，陳振明，等. 微生物降解多環芳烴的研究進展[J]. 微生物學雜志，2007，27（6）：100-103.

[31]毛健，駱永明，滕應，等. 一株高分子量多環芳烴降解菌的篩選、鑒定及降解特性研究[J]. 微生物學通報，2008，35（7）：1011-1015.

[32]Liu R，Xiao N，Wei S，et al. Rhizosphere effects of PAH-contaminated soil phytoremediation using a special plant named Fire Phoenix[J]. The Science of the Total Environment，2014，473/474（3）：350-358.endprint