CSFV的反向遺傳系統

趙妍

（武漢大學生命科學學院，武漢 430072）

1 引言

反向遺傳學是利用病毒的全長基因組來產生完整病毒的方法，是現在病毒學研究中最強有力的工具。反向遺傳學通常用于研究病毒復制、感染、蛋白功能、病毒與宿主的相互作用、抗病毒及疫苗研究[1]。近年來，反向遺傳學在CSFV的研究方面得到不斷發展，本文就CSFV的幾種反向遺傳系統進行系統闡述，以期為CSFV的研究及防控提供參考。據統計，我國每年因豬瘟造成的經濟損失已超過100億元。豬瘟嚴重阻礙養殖業的健康發展，并對食品安全造成威脅。因此，對該病進行全面、綜合防控，具有必要的現實意義。本文對CSFV及功能相關基因、蛋白的研究進展進行介紹，為全面了解CSFV、全方位防控豬瘟提供理論支持。

2 CSFV的幾種反向遺傳系統

2.1 T7 RNA聚合酶介導的體外轉錄反向遺傳學系統

T7 RNA聚合酶，是一種高度特異識別T7啟動子序列的DNA依賴的5'→3'RNA聚合酶。T7 RNA Polymerase可以催化單鏈或雙鏈DNA T7啟動子下游NTP的摻入，合成與T7啟動子下游的模板DNA互補的RNA[2]。

Meyers（Meyers et al.,1996）首先對 CSFV 5’到 3’進行了全基因組鑒定，將CSFV全基因組克隆到低拷貝質粒中，并在基因組3’端加入T7啟動子，利用Srf I將質粒線性化后，在T7 RNA聚合酶作用下體外轉錄得到RNA，并轉染進SK6細胞系中拯救病毒，這一方法在現在的CSFV研究中依然應用十分廣泛。Fan（Fan et al.,2009）將上述方法進行了改進，將由T7 RNA聚合酶體外轉錄產生的vRNA轉染到BHK21細胞系中，培養一段時間后，將含有病毒的上清感染PK15細胞，用此方法得到的CSFV病毒滴度是之前的8倍左右。

2.2 T7 RNA聚合酶介導的體內轉錄反向遺傳學系統

Gennip（Gennip et al.,1999）建立了一種更方便、高效的體內轉錄反向遺傳系統。首先他建立了可以穩定表達T7 RNA聚合酶的SK6細胞系SK6-T7 RNA pol，將線性化的CSFV cDNA轉染該細胞系，轉錄過程在細胞中完成并得到病毒RNA，產生CSFV病毒，該方法大大提高了病毒滴度，其滴度約為體外轉錄的 200 倍[3]。Bergeron（Bergeron,2002）通過在 CSFV 3’端插入了HDV核酶及T7終止子，構建了一種新型的基于T7 RNA聚合酶的體內轉錄反向遺傳學系統，該系統不需要Srf I就能在CSFV末端形成精確的3’NCR，節約了構建成本。

2.3 II型RNA聚合酶介導的反向遺傳學系統

Li（Li et al.,2013）在CSFV 5’NCR加入 CMV啟動子、T7啟動子和HamRZ，在3’NCR加入HdvRZ，T7終止子和SV40 polyA，HamRZ與HdvRZ可以生成正確的5’NCR及 3’NCR，且能在T7 RNA聚合酶或者II型RNA聚合酶的作用下進行轉錄，該方法拯救的病毒滴度是體外轉錄的120倍。

2.4 I型RNA聚合酶介導的反向遺傳學系統

本實驗室在上述基礎上，構建了一種新的依賴polⅠ拯救病毒的CSFV cDNA克隆，我們在PK15細胞基因組中擴增得到豬的啟動子，并參照文獻合成在哺乳動物細胞中具有極高終止效率的鼠終止子，分別插入CSFV 5’NCR之前和3’NCR之后。該系統能直接將質粒轉染到細胞中，拯救出CSFV病毒，這種基于polⅠ啟動子的反向遺傳操作系統能產生具有精確末端基因組的CSFV，且具有更高的拯救效率，為后續修飾性減毒活疫苗和標記疫苗的研發奠定了堅實的基礎。

3 帶有標記的CSFV反向遺傳系統

基于傳統的反向遺傳系統，具有標記或定量功能的CSFV cDNA克隆被設計出來，如在Li實驗組建立了一種簡化的中和抗體試驗，用于檢測CSFV，首先在Npro后插入了EGFP基因，在病毒產生的同時合成EGFP，從而省去熒光染色，達到檢測病毒的目的[4]。本實驗室在1.4中的反向遺傳系統的基礎上，在Npro后面加入了Rluc基因，得到了可以用于定量實驗的CSFV反向遺傳系統，即可以通過收集Rluc氧化過程中釋放的生物熒光，定量地檢測轉錄因子與目的基因的相互作用。

帶有標記的CSFV反向遺傳系統在傳統的反向遺傳系統的基礎上，進一步簡化了實驗步驟，在達到實驗目的的同時，使反應更加快速，簡便，增加了方法的實用性，為后續開展修飾性減毒活疫苗和標記疫苗的研發做了很好的鋪墊。

4 展望

反向遺傳操作系統為RNA病毒研究提供了一個強有力的平臺，能夠恢復具有全長病毒基因組的病毒[5]。利用這個平臺，人們可以通過基因重組、基因突變等 手段來研究病毒的復制、感染，病毒蛋白的功能、病毒與宿主細胞之間的關系。抗病毒策略和標記疫苗的發展也離不開反向遺傳操作，如找出與毒力相關性基因，對其進行缺失或修飾處理，從而得到新的無毒或減毒毒株，以此制備新型的減毒活疫苗，同時可以制備嵌合抗體，開發多價疫苗[6]。反向遺傳系統作為動物病毒的研究方法，已廣泛應用于動物疫苗、CSFV毒力機制及蛋白功能研究中，極大地推動了動物病毒的研究發展，為疾病的研究及防控起著重要作用。