二代測序技術對活動性結核病患者的診斷價值

周晛 艾靜文 崔鵬 阮巧玲 沈瑤杰 王森 李永軍 張文宏

活動性結核病一直是臨床診治的難點，臨床表現不典型及肺外結核感染都增加了診斷難度。由于結核分枝桿菌的微生物學特點，傳統的病原學檢查敏感度低且周期較長，不能滿足臨床對活動性結核病快速病原學診斷的迫切需求。二代測序(next-generation sequencing, NGS)技術作為新興的實驗室檢查手段已被報道用于諸多病原體的診斷，但在活動性結核病中仍缺乏臨床應用實例，診斷價值尚不明確。本研究為前瞻性隊列研究，以臨床懷疑活動性結核病患者為研究對象，旨在考察NGS技術在活動性結核病中的診斷效能，并研究其相對于傳統診斷手段、Xpert MTB/RIF在活動性結核病病原學診斷上的效能差異。

材料和方法

一、納入、排除標準及診斷依據

1. 入組標準：(1)年齡大于18歲；(2)臨床懷疑活動性結核病患者，包括：肺結核、結核性腦膜炎、結核性胸膜炎、結核性腹膜炎、骨關節結核、各部位的結核膿腫等，并具有相應的提示活動性結核病的臨床癥狀及體征；(3)送檢臨床標本至華山醫院二代測序平臺，且送檢標本符合NGS檢測要求，具體要求為：血液標本不少于1 ml，腦脊液、胸腔積液、腹腔積液、心包積液、痰標本、支氣管肺泡灌洗液、鼻咽分泌物、膿液不少于0.5 ml；(4)簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會批準。

2. 排除標準：(1)標本送檢時患者主要診斷為除結核分枝桿菌外其他病原體感染或腫瘤、自身免疫性疾病等非感染性疾??；(2)送檢標本量不能滿足NGS檢測要求；(3)拒絕簽署知情同意書者。

3. 診斷依據：(1)確診活動性結核感染：上述送檢標本結核分枝桿菌培養陽性、病理診斷為結核感染、Xpert MTB/RIF檢測陽性及結核分枝桿菌核酸檢測陽性等4項中至少1項符合即可確診為活動性結核??；(2)臨床診斷為活動性結核?。号R床可疑為活動性結核病，排除其他病原體感染或腫瘤、自身免疫性疾病等非感染性疾病，且抗結核藥物治療有效；(3)排除活動性結核病：有其他病原學依據或符合腫瘤、自身免疫性疾病等非感染性疾病診斷標準。

二、納入研究的對象及標本

選擇2017年3月1日至2017年9月1日期間來華山醫院就診的34例臨床懷疑為活動性結核病患者的標本進行NGS檢測。呼吸道標本4例，均為支氣管灌洗液；肺外標本30例，其中腦脊液18例，胸腔積液4例，膿液3例，腹腔積液、肝組織各2例，關節積液1例。除肝組織及關節積液標本未行Xpert MTB/RIF檢測外，余31例標本均進行了NGS檢測、Xpert MTB/RIF檢測、結核分枝桿菌培養或病理檢查。

三、設備與檢測方法

送檢標本均在BGISEQ-100平臺上行NGS，測序所得病原序列和病原數據庫進行比對得到最終結果。以檢測到結核分枝桿菌復合群唯一匹配序列為陽性，未檢測到唯一匹配序列為陰性。

四、統計學方法

采用Microsoft Office Excel 2016及SPSS 22.0軟件進行分析。計數資料采用“例數”和“率”表示，計算NGS在結核病診斷中的敏感度、特異度。配對樣本與其他診斷手段的比較采用McNemar檢驗，并計算一致度。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、隊列標本及診斷結果

在上述標本中，確診為活動性結核病患者9例，其中Xpert MTB/RIF 陽性6例，病理診斷4例，培養陽性3例，結核核酸PCR檢測陽性1例；臨床診斷為活動性結核病患者10例、非結核感染患者15例(圖1)。

圖1 34例隊列標本及診斷結果

二、NGS檢測結核分枝桿菌的敏感度及特異度

以傳統診斷手段為金標準，即在9例確診的活動性結核病患者中，NGS敏感度為66.7%(6/9)；以臨床最終診斷為金標準，即在9例確診患者和10例臨床診斷為活動性結核病患者中，NGS敏感度為57.9%(11/19)。在15例排除活動性結核感染患者中，NGS均未檢出結核序列，特異度為100.0%。

表1 以臨床診斷為金標準時，傳統方法、Xpert MTB/RIF與NGS檢測的敏感度及特異度

注敏感度=該方法檢出陽性例數/臨床診斷為活動性結核病例數×100%；特異度=該方法檢出陰性例數/排除活動性結核病例數×100%

三、NGS與傳統結核病診斷手段的比較(表2)

在34例NGS與傳統結核病診斷試驗同步進行檢測的標本中，結核分枝桿菌培養陽性和(或)病理診斷為結核感染者共有6例。NGS陽性而傳統手段陰性的標本有腦脊液5例，關節積液標本1例，肺泡灌洗液1例；傳統手段單陽性的標本為軟組織感染膿液和腦脊液各1例。以臨床診斷為金標準，NGS和傳統檢測手段兩者的敏感度分別為31.6%(6/19)和57.9%(11/19)，特異度均為100.0%(15/15)。兩者差異無統計學意義(McNemar檢驗，P=0.180)，一致度為73.5%。

四、NGS與Xpert MTB/RIF比較(表3)

在平行送檢Xpert MTB/RIF與NGS的31例標本中，Xpert MTB/RIF 陽性6例。Xpert MTB/RIF單陽性3例：腹腔積液、前臂膿液、腦脊液各1例；NGS單陽性5例：腦脊液4例和灌洗液1例。以臨床診斷為金標準，NGS和Xpert MTB/RIF兩者的敏感度分別為50.0%(8/16)與37.5%(6/16)，特異度均為100.0%(15/15)。兩者比較差異無統計學意義(McNemar檢驗，P=0.727)，一致度為74.2%。

表2 34例標本NGS與傳統結核檢測的結果比較(例)

表3 31例標本NGS與Xpert MTB/RIF檢測的結果比較(例)

討 論

NGS是一種高通量測序方法，可以對 DNA 或 RNA 樣本的堿基對進行快速測序。作為新興的分子診斷一員已經被報道用于細菌[1-2]、真菌[3]、病毒[4]等多種感染性疾病的診斷，但目前僅為病例報告，缺乏高等級的循證醫學證據。本研究旨在通過前瞻性隊列研究的方式，首次評估NGS這一新技術用于結核病診斷的價值。

長久以來結核病的診斷一直依靠傳統的結核分枝桿菌抗酸染色涂片和培養技術。雖然培養仍然是結核病診斷的金標準，但這并不能滿足臨床快速診斷的需要。近年來出現了多種結核病新的診斷技術和方法，分子診斷技術是近幾年的重要突破，其代表即Xpert MTB/RIF檢測試劑盒。WHO強烈推薦Xpert MTB/RIF應用于成人、兒童疑似耐藥結核病，以及HIV感染與MTB雙重感染患者的初始檢測；并推薦用于疑似肺外結核患者的肺外標本，如腦脊液、淋巴結和其他組織等的檢測[5]；并且由于其特異度達到95%以上，可以作為結核病確診實驗。但是，無論是培養還是Xpert MTB/RIF，其敏感度、尤其是在肺外結核中仍然很低，所以在結核診斷試驗的評估中，仍需要以臨床診斷作為參考標準。因此，本研究在評估NGS對于結核病的診斷價值時，分別以確診患者和臨床診斷患者為標準，以減小偏倚。

本研究中，傳統診斷手段、Xpert MTB/RIF和NGS特異度均為100.0%，敏感度分別為31.6%、37.5%、57.9%。NGS在三者中最高，雖然差異無統計學意義，但考慮可能受樣本量所限。進一步分析發現，NGS陽性而傳統檢測手段或Xpert MTB/RIF陰性，而臨床診斷為活動性結核病的標本以腦脊液為主，但是培養和Xpert MTB/RIF檢測在結核性腦膜炎中的陽性率仍然較低[6]，提示NGS在結核性腦膜炎的診斷中可能存在優勢。就檢測速度而言，Xpert MTB/RIF(為2 h)

在本研究中，檢出結核分枝桿菌復合群唯一比對序列即作為陽性判斷，但就原始NGS檢測數據，往往在檢出MTB的同時，也可以檢測到許多其他病原體的序列[3]。這是NGS相對于Xpert MTB/RIF等僅對MTB的針對性檢測在用于疑難感染檢測上的優勢，但也給最終報告的解讀帶來了困難[8]。且MTB感染相對于其他病原體，樣本中的檢出序列數可能更低[3, 9]。這些問題有待于在更大規模的研究中得到解決。

根據本研究數據，筆者認為NGS能夠較為快速地檢測多類標本中的結核分枝桿菌復合群，且其敏感度及特異度與Xpert MTB/RIF相當，可以作為確診試驗用于活動性結核病的早期輔助診斷。

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