重慶地區耐多藥結核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥基因突變的特征分析

朱大冕 胡代玉 劉潔 逄宇 羅明 沈靜 陳林

吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)是目前被廣泛應用于結核病治療的4種一線藥物之一，其可以抑制酸性環境中處于半休眠期的結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)。PZA是一種前藥，需要MTB的pncA基因(蛋白編碼序列為561 bp)編碼的吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase，PZase)將其轉化為酸性形式的吡嗪酸(pyrazinoic acid，POA)才能發揮作用[1]。有文獻報道，75%的PZA耐藥MTB存在pncA突變[2-3]。PZA的活性成分POA通過抑制核糖體蛋白RpsA 的活性來抑制MTB的生長[4]。rpsA基因的超量表達使得MTB對PZA的最小抑菌濃度升高了5倍，并且在少數PZA低度耐藥株中存在rpsA基因的突變。因此，筆者對重慶地區耐多藥結核分枝桿菌(MDR-MTB)pncA基因和rpsA基因的突變特征及其與PZA耐藥性的相關性進行研究，以期望建立快速檢測MTB的PZA耐藥性的分子診斷學方法[5]。

材料和方法

1.標本來源：收集2014年11月至2016年2月重慶市結核病防治所“MTB耐多藥項目”中所屬39個區(縣)的133株MDR-MTB臨床分離菌株。MTB標準株H37Rv來自中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心國家結核病參比實驗室。

2.試劑：(1)1%標準比例法固體藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)所采用的含藥及對照培養基，菌種鑒定所用對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸酰肼(TCH)培養基，均購于珠海貝索生物技術有限公司。含藥培養基的終濃度分別為：異煙肼(INH)0.2 μg/ml，利福平(RFP)4 μg/ml，鏈霉素(Sm)2 μg/ml，乙胺丁醇(EMB)40 μg/ml，氧氟沙星(Ofx)2 μg/ml，卡那霉素(Km)30 μg/ml，卷曲霉素(Cm)40 μg/ml，丙硫異煙胺(Pto)40 μg/ml，對氨基水楊酸(PAS)1 μg/ml，阿米卡星(Am)30 μg/ml。(2)PZA液體藥敏檢測采用BACTEC MGIT 960系統，采用BACTEC MGIT 960 PZA藥敏試劑盒(包括PZA藥物和PZA添加劑)，液體培養基為改良Middlebrook 7H9(pH=5.9)，其中PZA含量100 μg/ml。

3. 1%標準比例法固體藥敏試驗及鑒定：選用臨床初次分離的菌株(出現肉眼可見菌落后2～3周的新鮮菌落)，用滅菌的接種環挑取改良羅氏培養基斜面上的菌落置于磨菌瓶中，渦旋振蕩10～20 s，以生理鹽水配成1麥氏濃度，并用生理鹽水稀釋至濃度為10-2mg/ml、10-4mg/ml的菌懸液。用22SWG標準接種環分別取1滿環(0.01 ml)稀釋好的菌懸液分別接種于對照和含藥培養基，直立放置，37 ℃培養，待菌落長出時觀察結果，根據耐藥百分比判讀：耐藥百分比=(含藥培養基上生長的菌落數/對照培養基生長的菌落數)×100%，若耐藥百分比大于1%，則認為受試菌對該抗結核藥耐藥。菌種鑒定：操作同固體藥敏實驗，用生理鹽水稀釋至濃度為10-1mg/ml的菌懸液，用22SWG標準接種環分別取1滿環(0.01 ml)稀釋好的菌懸液接種于PNB和TCH培養基。

4. BACTEC MGIT 960系統法：每株菌需準備2支MGIT 960培養管(1管為生長對照管，1管為加藥管)，每管加0.8 ml的PZA添加劑，在標記有PZA的培養管加入100 μl的PZA藥物。配置菌懸液同比例法，調節濁度為0.5麥氏濃度，移取0.5 ml此菌懸液至4.5 ml生理鹽水，做1∶10稀釋，混勻。加0.5 ml稀釋后的菌液至生長對照管，混勻。在PZA藥物管中加入0.5 ml未稀釋的菌液，混勻。將準備好的MGIT管放入標記好的藥敏試驗試管架，并按照放管程序放入BACTE MGIT 960儀器，選擇PZA藥敏試驗試管架。MGIT 960儀器會在4～13 d內，根據生長單位(growth unit)值，自動報告藥敏試驗結果。

5. DNA提取：采用接種環(10 μl)從羅氏培養基斜面刮取適量菌苔至螺旋口離心管，加入0.5 ml去離子水，振蕩混勻，85 ℃金屬浴30 min滅活；12 000×g離心5 min，棄上清；加入0.5 ml 1×TE緩沖液重懸，100 ℃金屬浴20 min；12 000×g離心5 min，吸取上清作為DNA模板，-20 ℃保存備用。

6. 基因測序：耐藥相關基因測序使用引物見表1。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。反應體系為：25 μl 2×Master MIX，1 μl上游引物，1 μl下游引物，4 μl的DNA模板，19 μl去離子水。耐藥基因pncA的PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，3個循環；最后72 ℃延伸10 min。耐藥基因rpsA的PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，100 V 35 min，應用凝膠成像儀觀察并確保成功擴增后，送北京擎科新業生物技術有限公司進行雙向測序。其測序結果采用Mega 6.0軟件進行比對和突變分析。

7.統計學分析：采用SPSS 17.0軟件對數據進行分析。采用描述性統計分析方法，計算MDR-MTB 菌株PZA耐藥率，不同特征人群分離的MDR-MTB 菌株PZA耐藥構成比，以及耐藥基因突變率；采用單因素分析方法(卡方檢驗)，分析MDR-MTB 菌株PZA耐藥影響因素；以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.藥敏試驗結果：133株MDR-MTB菌株中83株 PZA耐藥、50株PZA敏感，耐藥率為 62.4%。MDR-MTB菌株中包含38株前廣泛耐藥結核和17株廣泛耐藥結核。菌株來源患者中，包括男80例(60.2%)，女53例(39.8%)；年齡19～76歲，中位年齡42(31～53)歲。初治患者49例，占36.8%，復治患者84例，占63.2%，見表2。

2.耐藥基因測序分析結果：(1)pncA基因突變結果：MTB標準菌株H37Rv未檢測到pncA突變。對pncA基因及其上游調控序列進行測序，序列分析顯示50株PZA敏感株中4株發生pncA基因突變，突變率為8.0%；83株PZA耐藥株中73株發生pncA基因突變，突變率為87.9%；PZA耐藥株的突變率明顯高于PZA敏感株，差異有統計學意義(χ2=81.82，P=0.000)。PZA耐藥株中共有48種突變類型，突變形式包括堿基置換(55株)、移碼突變(16株)、整碼突變(2株)。堿基突變區域分別集中在位點20～40(10株)、136～146(6株)、185～226(10株)、392～408(15株)區域。9株在395位堿基發生G→A的單堿基突變，導致氨基酸由甘氨酸→天冬氨酸的改變；5株在185位堿基發生C→T單堿基突變，氨基酸改變為脯氨酸→亮氨酸；4株在啟動子區-11位堿基發生A→G突變。同時發現有18種新的突變類型，包括7種點突變(T2C、T37G、T94G、C206T、G319A、C437T、T488C)，8種插入突變(52插入GCC、130插入C、139插入CA、232插入C、243插入T、288插入A、393插入GGT、408插入CA),3種缺失突變(341缺失ACGCC、342缺失GCCAC、376缺失GATGAGGTC)，見表3。PZA敏感株中4株發生了pncA基因突變，包括C184A、C185A、C200G、G461A，見表4。(2)rpsA基因突變結果：對擴增產物測序后與NCBI H37Rv標準序列做比對，標準菌株H37Rv未檢測到rpsA基因突變，133株MDR-MTB菌株未發現有rpsA基因突變。

表1 耐藥相關基因測序使用引物

表2 各因素對133株MDR-MTB菌株PZA耐藥的影響分析

表3 對PZA耐藥的MDR-MTB菌株pncA基因突變情況

表4 PZA敏感的MDR-MTB菌株pncA基因突變情況

討 論

本研究通過對重慶地區133株MDR-MTB進行檢測及相關資料分析，發現重慶地區MDR-MTB的PZA耐藥率較高(62.4%)，復治是PZA耐藥的危險因素之一。其中，PZA耐藥株pncA突變率為87.9%，明顯高于PZA敏感株pncA突變率(8.0%)，且PZA耐藥株中未發現rpsA基因突變，此結果提示MDR-MTB菌株PZA耐藥與pncA突變相關。

目前，重慶地區并未常規開展MTB的PZA藥敏試驗，本地區PZA耐藥情況未見相關報道。本研究結果顯示，重慶地區MDR-MTB菌株對PZA有較高耐藥率，這為臨床用藥尤其對于耐多藥結核病患者用藥有很大的指導作用。筆者對患者資料進行單因素分析顯示，復治是PZA耐藥的危險因素，這可能與復治患者中的耐多藥結核病患者比例高有關。盡管納入的患者中男性構成比高于女性，且30～59歲的人數最多，但未發現不同性別和年齡患者的MDR-MTB菌株對PZA耐藥是否有影響。

研究證實，PZase的失活是MTB對PZA產生耐藥的主要機制[6-7]，而pncA作為PZase的編碼基因，其突變會使MTB的PZase活性降低或失活，從而使MTB產生對PZA的耐藥性。本研究中 PZA耐藥株pncA突變率為87.9%，與國外文獻報道的pncA基因突變率(69.0%～98.8%)相似[1，8-11]，但高于國內近幾年其他地區的報道結果[12-15]。PZA耐藥株中共有47種突變類型，主要以堿基置換為主。9株在395位堿基發生G→A的單堿基突變，這是本研究中最為常見的突變類型，也可能是重慶地區MDR-MTB菌株pncA基因特征性突變位點。但是，該突變導致PZase的改變從而導致耐藥產生的機制，需進一步研究。4株菌株在啟動子區-11位堿基發生A→G突變，也是其他國家報道過的突變類型[16-17]，這提示pncA上游調控序列的改變同樣會影響PZase的活性從而導致PZA耐藥。堿基突變所集中的4個區域為位點20～40、136～146、185～226、392～408，這些集中區域與以往的報道有所不同[1,18]；對PZA耐藥菌株的pncA基因中發現有18種此前未報道的新突變類型，分別發生在19株菌株中[19-24]，這些研究結果提示pncA基因突變具有多態性和地區差異性。因此，了解本地區MDR-MTB菌株pncA基因突變的特征對于PZA耐藥分子生物學診斷方法的研發和應用非常必要。

PZA耐藥株有10株均未檢測到pncA基因或rpsA基因突變，除外PZA藥敏試驗結果不準確的因素外，提示可能還存在非pncA基因和rpsA基因突變的其他耐藥機制[25-26]。PZA耐藥株pncA基因突變位點比較分散，從核苷酸-11～515位均有出現，隨機散布在整個pncA基因上包括調控序列，無固定的突變位點，這與其他研究結果一致[1,27]，提示pncA基因突變導致的任何一個氨基酸改變都可能影響PZase的活性，不能將PZA轉化成有活性的POA。

本研究中，PZA敏感株中有少量發生pncA基因突變。首先，PZA藥敏試驗所采用的MGIT 960系統在做PZA藥敏試驗時需用特殊的酸性培養基，臨床分離的菌株在酸性環境下生長會受到抑制，這就有可能得到錯誤的藥敏試驗結果[28]。其次，PZA敏感株中發生的突變與耐藥株的突變并不相同，這也提示這些位點的某些突變類型不能對PZase產生影響或是不會使PZase失去活性。

研究顯示，由rpsA基因編碼的核糖體蛋白質S1(RpsA)是POA的一個作用靶蛋白，是與MTB菌株對PZA耐藥有關的蛋白質[4]。此后該結論也得到Simons等[29]的證實。但本次研究中，133株MDR-MTB并未發現有rpsA基因突變，這可能與菌株數量較少有關，但仍提示該基因的突變并不是PZA耐藥的常見機制，這與國內外相關報道相符合[30-32]。

綜上所述，本研究發現重慶地區MDR-MTB中對PZA的耐藥率較高，且pncA基因突變是重慶地區MTB對PZA耐藥的主要機制，可通過對pncA基因進行序列分析對重慶地區PZA耐藥株進行快速篩查，及時為臨床治療提供參考。

[1] Scorpio A, Lindholm-Levy P, Heifets L, et al. Characterization ofpncAmutations in pyrazinamide-resistantMycobac-teriumtuberculosis. Antimicrob Agentd Chemother, 1997, 41(3): 540-543.

[2] Pérez-Osorio AC, Boyle DS, Ingham ZK, et al. Rapid identification of mycobacteria and drug-resistantMycobacteriumtuberculosisby use of a single multiplex PCR and DNA sequencing. J Clin Microbiol, 2012, 50(2): 326-336．

[3] Cheng SJ, Thibert L, Ssanchez T, et al.pncAmutations as a major mechanism of pyrazinamide resistantce inMycobacteriumtuberculosis: spread of a monoresistant strain in Quebec, Canada. Antimicrob Agents Chemother, 2000, 44(3): 528-532．

[4] Shi W, Zhang X, Jiang X, et al. Pyrazinamide inhibits trans-translation inMycobacteriumtuberculosis．Science, 2011, 333(6049): 1630-1632．

[5] 胡嚴杰, 黃海榮. 結核分枝桿菌對吡嗪酰胺耐藥的檢測方法研究與進展. 中國防癆雜志, 2016, 38(9): 761-764.

[6] Singh P, Wesley C, Jadaun GP, et al． Comparative evaluation of L?wenstein-Jensen proportion method, BacT/ALERT 3D system, and enzymatic pyrazinamidase assay for pyrazinamide susceptibility testing ofMycobacteriumtuberculosis． J Clin Microbiol, 2007, 45(1): 76-80．

[7] Krishnamurthy A, Almeida D, Rodrigues C, et al. Comparison of pyrazinamide drug susceptibility ofM．tuberculosisby radiometric BACTEC and enzymatic pyrazinamidase assay. Indian J Med Microbiol, 2004, 22(3): 166-168.

[8] Muthaiah M, Jagadeesan S, Ayalusamy N, et al. Molecular epidemiological study of pyrazinamide-resistance in clinical isolates ofMycobacteriumtuberculosisfrom South India. Int J Mol Sci, 2010, 11(7): 2670-2680.

[9] Mirabal NC, Yzquierdo SL, Lemus D, et al. Evaluation of colorimetric methods using nicotinamide for rapid detection of pyrazinamide resistance inMycobacteriumtuberculosis. J Clin Microbiol, 2010, 48(8): 2729-2733.

[10] McCammon MT, Gillette JS, Thomas DP, et al. Detection by denaturing gradient gel electrophoresis ofpncAmutations associated with pyrazinamide resistance inMycobacteriumtuberculosisisolates from the United States-Mexico border region. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(6): 2210-2217.

[11] Zimic M, Sheen P, Quiliano M, et al. Peruvian and globally reported amino acid substitutions on theMycobacteriumtuberculosispyrazinamidase suggest a conserved pattern of mutations associated to pyrazinamide resistance. Infect Genet Evol, 2010, 10(2): 346-349.

[12] 李洪敏, 吳雪瓊, 王巍, 等. 結核菌耐藥pncA和embB基因突變與臨床治療的研究. 中國醫師雜志, 2004, 6(6): 742-744．

[13] 姜英, 彭俊平, 楊帆, 等. 結核分枝桿菌耐吡嗪酰胺分子機制研究. 微生物學免疫學進展, 2007, 35(1): 5-9．

[14] 何秀云, 莊玉輝, 李國利, 等. 耐吡嗪酰胺結核分枝桿菌基因突變研究. 中華檢驗醫學雜志, 2008, 31(3): 301-304．

[15] 石潔, 李輝, 馬曉光, 等. 河南省結核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥基因pncA分析. 中國病原生物學雜志, 2013, 8(9): 796-798.

[16] Portugal I, Barreiro L, Moniz-Pereira J, et al.pncAmutations in pyrazinamide-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates in Portugal. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(7): 2736-2738.

[17] Park SK, Lee JY, Chang CL, et al.pncAmutations in clinicalMycobacteriumtuberculosisisolates from Korea. BMC Infect Dis, 2001, 1: 4.

[18] 曾濤, 朱中元. 結核分枝桿菌耐藥分子機制及檢測方法的研究進展. 中國熱帶醫學, 2008, 8(3): 481-484.

[19] Simons SO, van Ingen J, vail der Laan T, et al. Validation ofpncAgene sequencing in combination with the mycobacterial growth indicator tube method to test suseeptibilitv ofMycobacteriumtuberculosisto pyrazinamide. J Clin Microbiol, 2012, 50(2): 428-434．

[20] Rodrigues Vde F, Telles MA, Ribeiro MO, et al. Characteri-zation ofpncAmutations in pyrazinamide-resistantMycobac-teriumtuberculosisin Brazil. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(1): 444-446.

[21] Lee KW, Lee JM, Jung KS, et al. Characterization ofpncAmutations of pyrazinamide-resistantMycobacteriumtuberculosisin Korea. J Korean Med Sci, 2001, 16(5): 537-543.

[22] Zimic M, Sheen P, Quiliano M, et al. Peruvian and globally reported amino acid substitutions on theMycobacteriumtuberculosispyrazinamidase suggest a conserved pattern of mutations associated to pyrazinamide resistance. Infect Genet Evol, 2010, 10(2): 346-349.

[23] Miotto P, Cabibbe AM, Feuerriegel S, et al.Mycobacteriumtuberculosispyrazinamide resistance determinants: a multicenter study. MBio, 2014, 5(5): e01819-14.

[24] Sheen P, Méndez M, Gilman RH, et al. Sputum PCR-single-strand conformational polymorphism test for same-day detection of pyrazinamide resistance in tuberculosis patients. J Clin Microbiol, 2009, 47(9): 2937-2943.

[25] Sreevatsan S, Pan X, Zhang Y, et al. Mutations associated with pyrazinamide resistance inpncAofMycobacteriumtuberculosiscomplex organisms. Antimicrob Agents Chemother, 1997, 41(3): 636-640.

[26] Hirano K, Takahashi M, Kazumi Y, et al. Mutation inpncAis a major mechanism of pyrazinamide resistance inMycobacteriumtuberculosis. Tuberc Lung Dis, 1997, 78(2): 117-122.

[27] Napiórkowska A, Augustynowicz-Kopec＇ E, Zwolska Z. Phenotypic characterization of pyrazinamide-resistantMycobacteriumtuberculosisisolated in Poland. Pneumonol Alergol Pol, 2010, 78(4): 256-262.

[28] 鄭惠文, 逄宇, 趙雁林. 結核分枝桿菌在不同pH值液體培養基中對吡嗪酰胺敏感度的研究. 中國防癆雜志, 2017, 39(2): 149-153.

[29] Simons SO, Mulder A, van Ingen J, et al. Role ofrpsAgene sequencing in diagnosis of pyrazinamide resistance. J Clin Microbiol, 2013, 51(1): 382.

[30] 胡族瓊, 蔡杏珊, 謝偉勝, 等. 吡嗪酰胺耐藥結核分枝桿菌pncA及rpsA基因突變特征分析. 中華檢驗醫學雜志, 2014, 37(4): 285-289．

[31] Alexander DC, Ma JH, Guthrie JL, et al. Gene sequencing for routine verification of pyrazinamide resistance inMycobacteriumtuberculosis: a role forpncAbut notrpsA. J Clin Microbiol, 2012, 50(11): 3726-3728.

[32] Tan Y, Hu Z, Zhang T, et al. Role ofpncAandrpsAgene sequencing in detection of pyrazinamide inMycobacteriumtuberculosisisolates from Southern China. J Clin Microbiol, 2014, 52(1): 291-297.