益生性植物乳桿菌對(duì)切達(dá)干酪揮發(fā)性風(fēng)味形成的影響

郝曉娜，張 健，楊亞威，余志堅(jiān)，曹永強(qiáng)，楊貞耐,*

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.東君乳業(yè)（禹城）有限公司，山東 德州 253000）

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵劑：乳酸乳球菌Lactoccocus lactis XZ3303和Lactococcus lactis ssp. cremoris QH27-1由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，L. plantarum 1-2由本實(shí)驗(yàn)室凍干保藏（活菌數(shù)11.0（lg（CFU/g）））；商品凝乳酶：Stamix 1150NB德國(guó)科漢森股份有限公司；脫脂乳粉 新西蘭恒天然集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

705型－80 ℃超低溫冰箱 美國(guó)Thermo Electron公司；50 L干酪槽 上海浦麗盛三環(huán)食品設(shè)備工程有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司；BCN-1360B超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DVB-CAR-PDMS手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器 美國(guó)Supelco公司；7890A-7000 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；CP124S分析天平 德國(guó)Sartorius公司；HZQ-Q恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CT3質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵菌株活化與接種

乳酸乳球菌XZ3303、QH27-1分別按體積分?jǐn)?shù)3%接種于12 g/100 mL脫脂乳中，30 ℃培養(yǎng)6～8 h，活化3 代后用作干酪的生產(chǎn)發(fā)酵劑，接種量為1.5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及益生菌的添加

益生菌添加方式實(shí)驗(yàn)分組如表1所示。益生菌干酪1和益生菌干酪2分別向100 mL巴氏殺菌乳中添加0.1、1 g L. plantarum 1-2凍干粉，至乳中益生菌L.plantarum 1-2活菌數(shù)分別為8.0（lg（CFU/mL））和9.0（lg（CFU/mL））。益生菌干酪3在排乳清后向100 g凝乳中拌入0.1 g的L. plantarum 1-2凍干粉，至凝乳中L. plantarum 1-2活菌數(shù)為8.0（lg（CFU/g））。

表1 干酪制作實(shí)驗(yàn)分組Table1 Experimental groups of cheeses

1.3.3 干酪制作流程

圖1 切達(dá)干酪制作流程圖Fig. 1 Schematic illustration of Cheddar cheese production

干酪制作過(guò)程如圖1所示。對(duì)照組干酪（未添加益生菌）的制作：鮮牛乳經(jīng)65 ℃、30 min巴氏殺菌后，冷卻至31 ℃，添加發(fā)酵劑（添加量體積分?jǐn)?shù)1.5%）；31 ℃保溫發(fā)酵45 min，添加凝乳酶，靜置40 min待乳凝固，用干酪刀切割成約長(zhǎng)8 mm的立方塊，緩慢攪拌以防止凝塊黏連，凝塊升溫至38 ℃（每5 min升高1 ℃），當(dāng)pH值降到6.1～6.2時(shí)，排除乳清，并于38 ℃堆釀。pH值降至5.4～5.5時(shí)，揉碎凝塊，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%食鹽，然后裝入干酪模具壓榨。真空包裝，并于4 ℃條件下成熟0、4、8、12 周[9]。

益生菌干酪1、2的制作：按照上述對(duì)照組干酪的工藝流程，原料乳滅菌后添加發(fā)酵劑，同時(shí)按照?qǐng)D1添加益生菌L. plantarum 1-2。益生菌干酪3的制作與對(duì)照組干酪的工藝流程相似，僅在向凝塊中添加食鹽后添加益生菌L.plantarum 1-2于凝塊中，混勻。

1.3.4 干酪的理化及微生物指標(biāo)測(cè)定

1.3.4.1 干酪得率的測(cè)定

在干酪制作過(guò)程中，準(zhǔn)確稱量并記錄原料乳、發(fā)酵劑、食鹽的用量以及干酪成品的產(chǎn)量，用于干酪得率計(jì)算。干酪得率是干酪加工過(guò)程中的重要參數(shù)之一，可反映工藝參數(shù)的經(jīng)濟(jì)合理性，評(píng)定干酪的生產(chǎn)效益，衡量產(chǎn)率提高工藝改進(jìn)的有效性。干酪得率計(jì)算方法如下式：

1.3.4.2 干酪含水量的測(cè)定

依據(jù)GB 5009.003—2010《食品中水分的測(cè)定》中的方法測(cè)定干酪含水量。

1.3.4.3 干酪pH值的測(cè)定

稱取10 g干酪樣品，磨碎后加入12 mL 50 ℃蒸餾水，勻漿處理1 min，樣品充分勻漿后，將樣品放置于50 ℃水浴中保溫處理30 min，5 000×g、20 ℃條件下離心15 min，去除上層脂肪，取下層溶液測(cè)定pH值。

1.3.4.4 干酪微生物指標(biāo)的測(cè)定

分別在干酪成熟的第0、4、8、12周取樣，平板涂布測(cè)定干酪樣品中L. plantarum 1-2的活菌數(shù)。準(zhǔn)確稱取11 g干酪加入99 mL 2 g/100 mL檸檬酸鈉溶液（40 ℃），勻漿處理2 min，用生理鹽水將樣品稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，吸取50 μL稀釋液均勻涂布于M17培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h，計(jì)算益生菌L. plantarum 1-2的活菌數(shù)。

1.3.5 干酪質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的測(cè)定

質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定干酪硬度、內(nèi)聚性和彈性3 個(gè)指標(biāo)。去掉干酪樣品上下及邊緣約5 mm的部分，將干酪樣品切成1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm大小的樣品。將樣品在室溫條件下放置30 min，使其溫度均衡，并避免樣品在測(cè)試過(guò)程中發(fā)生溫度變化。質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)設(shè)定如下：測(cè)試前速度2.0 mm/s，測(cè)試速度0.4 mm/s，返回速度0.4 mm/s，循環(huán)2 次，數(shù)據(jù)頻率20 點(diǎn)/秒，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載5 g，壓縮比50%，探頭型號(hào)TA11/1000。

1.3.6 干酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析對(duì)比干酪風(fēng)味成分。稱取5 g干酪樣品，磨碎后加入到30 mL萃取瓶中，將萃取瓶加蓋密封，置于50 ℃水浴鍋中平衡20 min，固相微萃取50 ℃吸附40 min后插入氣相色譜進(jìn)樣口，250 ℃條件下解吸5 min。

1.3.6.1 色譜條件

程序升溫：初始溫度為40 ℃，在此溫度下保持3 min，然后以5 ℃/min的速度升溫至200 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min的速度升溫到250 ℃，保持3 min，后運(yùn)行3 min。載氣（He）恒定流速為1.2 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比為5∶1。

1.3.6.2 質(zhì)譜條件

電子電離源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 40～250。

1.3.6.3 干酪風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索同時(shí)與NIST08質(zhì)譜圖相匹配，并結(jié)合人工圖譜解析及相關(guān)資料分析，確認(rèn)揮發(fā)性物質(zhì)的各個(gè)化學(xué)成分，根據(jù)化合物的峰面積，按面積歸一化法計(jì)算出各成分的相對(duì)含量。

揮發(fā)性化學(xué)成分作為變量，成熟時(shí)間、益生菌添加量和益生菌添加方式作為環(huán)境因子，每個(gè)樣品不同成熟期的干酪作為一個(gè)樣本，應(yīng)用CANOCO 4.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。首先，根據(jù)梯度長(zhǎng)度分析結(jié)果，確定冗余分析模型的適用性。之后，依次設(shè)置軟件分析參數(shù)：Available Data=Species and environment data available，Scaling: Linear Methods=Do not post-transform，Transformation of Species D=Log transformation，對(duì)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行冗余分析，研究環(huán)境因子、變量、樣本之間的相互關(guān)系。

應(yīng)用Cluster 3.0對(duì)風(fēng)味物質(zhì)和樣品進(jìn)行聚類。導(dǎo)入文本文件至Cluster 3.0軟件，設(shè)置軟件分析參數(shù)：Adjust Data=Log transform data，選擇Hierarchical=Genes和Arrays下的Cluster，點(diǎn)擊Average linkage對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)和樣本進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干酪理化及微生物指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.1.1 干酪得率分析

表2 干酪得率Table2 Cheese yield

由表2可知，對(duì)照組干酪得率顯著低于添加了益生菌L. plantarum 1-2的干酪組，益生菌干酪1、2、3三組干酪得率無(wú)顯著差異。這可能是因?yàn)長(zhǎng). plantarum 1-2為產(chǎn)EPS的益生菌，能夠有效結(jié)合干酪中游離的水分，從而提高干酪得率。Dabour等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與不添加產(chǎn)EPS發(fā)酵劑生產(chǎn)的低脂切達(dá)干酪相比，添加了產(chǎn)黏液多糖或產(chǎn)莢膜多糖發(fā)酵劑生產(chǎn)的低脂切達(dá)干酪的水分含量增加量分別為3.6%和4.8%，干酪得率分別增加了0.28%和1.19%。

2.1.2 干酪含水量分析

干酪含水量不僅會(huì)影響干酪得率，還會(huì)對(duì)干酪的品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。因此，在干酪的成熟過(guò)程中，加強(qiáng)對(duì)干酪含水量的檢測(cè)和控制有重要意義。從圖2可以看出，在干酪成熟的過(guò)程中，4 種干酪含水量隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，下降趨勢(shì)緩慢；且不添加益生菌L. plantarum 1-2的對(duì)照組干酪變化較為明顯，而益生菌干酪1、2、3組含水量下降相對(duì)緩慢，差異性小。可能是干酪成熟期間，酶和微生物水解蛋白質(zhì)使干酪的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞，產(chǎn)生大量游離水，游離水造成干酪成熟期間水分下降[25]。益生菌干酪含水量下降慢的原因可能是益生菌L. plantarum 1-2產(chǎn)生EPS結(jié)合更多的水。Costa等[26]分別利用產(chǎn)EPS的L. lactis ssp.cremoris DPC6532及其不產(chǎn)EPS的同基因型變種菌株L. lactis ssp. cremoris DPC6533作為發(fā)酵劑生產(chǎn)低脂切達(dá)干酪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加了產(chǎn)EPS發(fā)酵劑生產(chǎn)出的干酪含水量和干酪得率顯著高于不產(chǎn)EPS組的干酪。

圖2 干酪成熟期間含水量的變化Fig. 2 Changes in moisture content during cheese ripening

2.1.3 干酪pH值分析

圖3 干酪成熟期間pH值的變化Fig. 3 Changes in pH during cheese ripening

由圖3可知，4 組干酪在成熟前期pH值下降速度較快，并達(dá)到最小值。這是由于在成熟前期，大量乳酸菌分解利用干酪中殘留的乳糖生成乳酸，使得干酪pH值迅速下降。而干酪在成熟的中后期乳糖被慢慢耗盡，隨著干酪成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)發(fā)生水解游離出的NH4＋與乳酸中和，導(dǎo)致pH值在成熟中期有小幅度上升[27]。在干酪成熟后期pH值趨于平穩(wěn)。但益生菌干酪組和對(duì)照組干酪pH值無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明益生菌L. plantarum 1-2的加入不會(huì)使干酪質(zhì)量發(fā)生明顯偏差，這對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)干酪至關(guān)重要。

2.1.4 干酪微生物指標(biāo)分析

對(duì)各組干酪成熟過(guò)程中L. plantarum 1-2的存活情況進(jìn)行測(cè)定。由表3可知，隨著干酪成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，干酪中的L. plantarum 1-2活菌數(shù)量降低。盡管益生菌干酪2中的L. plantarum 1-2添加量最多，其活菌數(shù)量下降顯著，這可能由于其在殺菌乳中添加，凝乳切割處理后排乳清時(shí)，大量菌體隨乳清排出而造成有效添加量降低。益生菌干酪1和益生菌干酪2中L. plantarum1-2的添加量不同，其成熟過(guò)程中活菌數(shù)變化表現(xiàn)出差異性。何志剛等[28]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌R23在枇杷酒中的菌體生物量總體也呈下降趨勢(shì)。益生菌干酪3中L. plantarum 1-2在排除乳清之后添加，減少了菌種隨乳清排出時(shí)的損失。益生菌干酪2和益生菌干酪3成熟12 周時(shí)，益生菌L. plantarum 1-2活菌數(shù)無(wú)顯著性差異，表明益生菌L. plantarum 1-2以9.0（lg（CFU/mL））添加量與主發(fā)酵同時(shí)添加到殺菌乳中與排除乳清后添加8.0（lg（CFU/g））對(duì)切達(dá)干酪成熟12 周后益生菌L. plantarum 1-2的活菌數(shù)無(wú)顯著影響。

表3 益生性L. plantarum1-2分別在干酪成熟0、4、8、12 周過(guò)程中的存活情況Table3 Viable count of L. plantarum1-2 in probiotic cheese after 0, 4,8, and 12 weeks of ripening（lg（CFU/g））

2.2 干酪質(zhì)構(gòu)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

由圖4可知，隨著干酪成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，4 組干酪的質(zhì)構(gòu)參數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在干酪成熟的1～4周內(nèi)，干酪的硬度、內(nèi)聚性和彈性迅速下降，這是由于干酪在成熟過(guò)程中，酪蛋白被干酪中殘余的凝乳酶及發(fā)酵劑菌株繼續(xù)水解，產(chǎn)生大量水溶性物質(zhì)，酪蛋白的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而導(dǎo)致干酪體系變得松散。而在干酪成熟中期和后期（4～12 周），下降有所減緩。由圖4A可以看出，在整個(gè)成熟期內(nèi)，對(duì)照組干酪的硬度始終高于益生菌干酪組，但差異并不顯著（P＞0.05）。推測(cè)是由于L. plantarum 1-2產(chǎn)生的EPS破壞了蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使其空間結(jié)構(gòu)變得疏松，從而導(dǎo)致硬度下降。張卓丹等[29]研究發(fā)現(xiàn)，EPS在干酪凝乳過(guò)程中，干擾蛋白質(zhì)之間的相互作用，導(dǎo)致干酪凝塊變軟。

內(nèi)聚性用于表征干酪在機(jī)械作用下裂解的速率，其外在表現(xiàn)是抗拉強(qiáng)度。由圖4B可知，在干酪成熟前期，4 組干酪內(nèi)聚性均呈下降趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）；在干酪成熟后期，對(duì)照組干酪內(nèi)聚性顯著高于益生菌干酪（P＜0.05）。干酪在成熟過(guò)程中，干酪內(nèi)部原有化學(xué)鍵的完整性遭到破壞，蛋白質(zhì)間的相互作用發(fā)生變化，在外力的作用下容易發(fā)生永久性變形，導(dǎo)致內(nèi)聚性下降，因此干酪的內(nèi)部結(jié)合力會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。

彈性參數(shù)用于表征干酪在外力作用后形狀的復(fù)原能力。由圖4C可以看出，干酪的彈性隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，4 周后下降速度趨于平緩。隨著干酪蛋白水解加快，干酪中長(zhǎng)鏈的結(jié)構(gòu)蛋白逐漸變短，酪蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)坍塌，從而導(dǎo)致干酪質(zhì)地變得柔軟，彈性變差。對(duì)照組干酪的彈性在整個(gè)干酪成熟期間均低于3 個(gè)益生菌干酪，在干酪成熟前期差異不顯著（P＞0.05）；在干酪成熟后期，即第8～12周，對(duì)照組干酪的彈性顯著低于益生菌干酪組（P＜0.05），推測(cè)是由于EPS破壞了蛋白質(zhì)的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使干酪質(zhì)地變得松軟，但益生菌干酪之間差異并不明顯（P＞0.05）。

2.3 干酪成熟期間的風(fēng)味物質(zhì)分析

由表4可知，4 組干酪在不同的成熟時(shí)期（0、4、8、12 周）特征性風(fēng)味物質(zhì)的變化，對(duì)照組干酪和益生菌干酪組的風(fēng)味物質(zhì)的種類和相對(duì)含量均存在較大差異。對(duì)照組干酪共檢測(cè)出風(fēng)味物質(zhì)26 種，其中烴類化合物6 種、醇類化合物6 種、醛類化合物2 種、酮類化合物4 種、脂肪酸類化合物5 種、酯類化合物3 種；益生菌干酪1、2、3中除上述26 種風(fēng)味物質(zhì)外，還檢測(cè)出乙苯、十二烷、己醇和丙酮4 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。Salmeron等[30]在植物乳桿菌發(fā)酵谷物中也鑒定到上述風(fēng)味物質(zhì)如乙醛、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。由圖5可知，各組干酪中不同種類風(fēng)味物質(zhì)的分布及相對(duì)含量具有一定的相似性，其中醇類物質(zhì)的相對(duì)含量最高，醛類物質(zhì)的相對(duì)含量最低；隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，醇類和酯類物質(zhì)相對(duì)含量有所下降，醛類和脂肪酸類物質(zhì)的相對(duì)含量有所上升。

表4 干酪中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量Table4 Volatile flavor compounds in cheese

圖5 干酪成熟期間對(duì)照組干酪（A）、益生菌干酪1（B）、益生菌干酪2（C）和 益生菌干酪3（D）風(fēng)味化合物的相對(duì)含量Fig. 5 Changes in flavor compound contents of control cheese (A),probiotic cheese 1 (B), probiotic cheese 2 (C) and probiotic cheese 3 (D)during cheese ripening

烴類化合物主要來(lái)源于原料乳本身[31]，而不是在干酪成熟過(guò)程中產(chǎn)生，它們的閾值相對(duì)較高，因此對(duì)干酪整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小[32]。烴類化合物在干酪中普遍存在，且種類較多，以C10～C22的烷烴和一些支鏈烯烴為主。與益生菌干酪組相比，對(duì)照組僅檢測(cè)出6 種烴類化合物（苯、癸烷、甲苯、十一烷、對(duì)二甲苯和十三烷），而在3 個(gè)益生菌干酪組中均檢測(cè)出8 種烴類化合物（還包括乙苯和十二烷），乙苯等雜環(huán)類化合物可賦予干酪堅(jiān)果味和杏仁味，使干酪風(fēng)味更加飽滿。

醇類化合物通常具有芳香味和植物香味，但因醇類化合物閾值較高，因此對(duì)干酪整體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。醇類化合物通常存在于干酪的水溶性成分中，可以與脂肪酸進(jìn)一步反應(yīng)形成酯，因此可間接影響干酪風(fēng)味。此外，通過(guò)氨基酸代謝、乳糖代謝以及甲基酮的還原等代謝途徑也可生成相應(yīng)的醇類。對(duì)照組干酪中檢測(cè)出6 種醇類化合物，即乙醇、3-甲基-1-丁醇、甲基丁烯醇、2-乙基-1-己醇、十六醇和苯乙醇，益生菌干酪1、2和3中還檢測(cè)出了己醇，己醇具有樹脂、花、植物的風(fēng)味。3-甲基-1-丁醇可賦予干酪水果香味和酒香味，從而對(duì)改善干酪風(fēng)味起到重要作用。在整個(gè)干酪成熟期內(nèi)，益生菌干酪中3-甲基-1-丁醇含量均高于對(duì)照組，表明L. plantarum 1-2的添加對(duì)干酪風(fēng)味有貢獻(xiàn)作用。此外，正己醇僅在益生菌干酪中檢測(cè)到，說(shuō)明此風(fēng)味物質(zhì)由L. plantarum 1-2代謝產(chǎn)生。在切達(dá)干酪中，醇類的過(guò)度積累會(huì)造成風(fēng)味缺陷[33]。本研究中，醇類化合物含量隨干酪成熟時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，有利于減少干酪的酸敗風(fēng)味。

醛類化合物是脂肪酸和游離脂肪酸發(fā)生自動(dòng)氧化而生成。在對(duì)照組干酪和益生菌干酪中均檢測(cè)出2 種醛類化合物，即己醛和壬醛。其中己醛能賦予干酪新鮮味和青草味，壬醛具有板油氣味，這2 種物質(zhì)在干酪中普遍存在。醛類化合物的化學(xué)性質(zhì)比較活潑，屬于不穩(wěn)定的中間體化合物，在一定條件下易被還原成相應(yīng)的醇，因此通常而言這類化合物在乳制品中的含量都不高。醛類物質(zhì)主要參與酸類物質(zhì)和酯類物質(zhì)間的相互轉(zhuǎn)化，能夠引起干酪不潔風(fēng)味的苯乙醛在本實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)出。

酮類化合物由多不飽和脂肪酸氧化、熱降解、氨基酸降解和微生物代謝產(chǎn)生，其感知閾值低，風(fēng)味獨(dú)特，可賦予干酪水果香味、花香味和霉味[34-35]，并隨著碳鏈的增加香氣更加濃郁[36]。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)照組中共檢測(cè)出4 種酮類化合物，包括2-庚酮、3-羥基丁二酮、2-壬酮和 2,7-二甲基-5-羥基-4-辛酮；在益生菌干酪組中還檢測(cè)出丙酮。由圖5可知，與對(duì)照組相比，益生菌干酪中酮類物質(zhì)含量較高，尤其是3-羥基丁二酮，該化合物由干酪的檸檬酸代謝所產(chǎn)生的二乙酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，賦予干酪清新的奶油香氣，使干酪風(fēng)味變得更為飽滿，進(jìn)一步提高干酪的感官品質(zhì)[37]。2-壬酮呈果香、甜香、青香及椰子、奶油的氣味[38]。2-庚酮是亞油酸的氧化產(chǎn)物，能賦予干酪水果香味。

脂肪酸類化合物是由乳脂肪經(jīng)脂肪酶水解形成的，有顯著的特征氣味，而且還是烷烴類、酯類和甲基酮等風(fēng)味物質(zhì)的前體。低碳數(shù)脂肪酸較低的閾值保證了干酪的典型發(fā)酵風(fēng)味[39]。在4 組干酪中均檢測(cè)出了乙酸、丁酸、己酸、辛酸和癸酸。其中乙酸是由乳酸或檸檬酸在發(fā)酵菌株的作用下生成，賦予干酪醋味；丁酸可賦予干酪多汁味、奶油味；己酸具有油脂味；其他飽和脂肪酸主要貢獻(xiàn)干酪的水果酸味和油酸味。辛酸具有清香和微弱的水果酸氣味、淡酸味[40]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的酸類化合物均為直鏈脂肪酸，為脂肪的水解產(chǎn)物，含量隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，對(duì)酯類化合物的形成具有很大貢獻(xiàn)，表明隨著干酪成熟時(shí)間的延長(zhǎng)脂肪的水解作用逐漸加強(qiáng)。

酯類化合物具有較低的閾值，通常提供甜味和水果味[41]，可以緩解短鏈酸類化合物帶來(lái)的尖刺感，使干酪的整體風(fēng)味更加柔和，然而過(guò)多的酯類化合物則容易引起干酪偏水果味的缺陷[42]。短鏈酯類化合物在常溫下?lián)]發(fā)性較強(qiáng)，并且具有較低的閾值，因此具有較大的風(fēng)味貢獻(xiàn)潛力。本實(shí)驗(yàn)中，這類化合物相對(duì)含量均隨干酪成熟時(shí)間延長(zhǎng)而下降，避免了水果味缺陷的產(chǎn)生。在4 組干酪中共檢測(cè)出3 種酯類化合物，分別為乙酸乙酯、乙酸乙烯酯和己酸乙酯。其中乙酸乙酯含量較高，賦予干酪水果香味，隨干酪成熟時(shí)間的延長(zhǎng)含量逐漸下降。在干酪成熟初期（0 周），乙酸乙酯便大量存在，第12周時(shí)，對(duì)照組干酪中乙酸乙酯相對(duì)含量為7.77%，低于益生菌干酪1（8.08%）、益生菌干酪2（8.54%）和益生菌干酪3（9.65%），說(shuō)明L. plantarum 1-2的添加對(duì)干酪風(fēng)味具有積極作用。

2.4 冗余分析益生菌L. plantarum 1-2對(duì)切達(dá)干酪成熟過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味含量和種類的影響

2.4.1 干酪成熟時(shí)間的影響

為了進(jìn)一步研究干酪成熟時(shí)間、益生菌活菌數(shù)和添加方式對(duì)干酪風(fēng)味形成的影響，對(duì)干酪的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。去趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（detrended correspondence analysis，DCA）結(jié)果顯示梯度長(zhǎng)度最大值為0.703，依據(jù)?milauer等[43]方法，統(tǒng)計(jì)分析梯度長(zhǎng)度小于3，適于線性分析模型，采用RDA線性模型分析。

圖6 干酪風(fēng)味物質(zhì)的冗余分析Fig. 6 Redundancy analysis of cheese flavor substances

如圖6所示，第1、2主成分對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的影響所能解釋的比例為70.9%。干酪成熟時(shí)間和橫軸的相關(guān)系數(shù)為0.867 3。箭頭代表不同的影響因素，其方向代表該因素對(duì)干酪風(fēng)味影響的取向，長(zhǎng)短代表對(duì)風(fēng)味影響的大小。干酪成熟時(shí)間射線最長(zhǎng)且沿著各組干酪成熟時(shí)間的方向，說(shuō)明成熟時(shí)間與干酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量呈正相關(guān)，且影響最大，這是因?yàn)闊o(wú)論是益生菌還是干酪中的酶類，其水解和產(chǎn)生揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)都是復(fù)雜的生化反應(yīng)，部分物質(zhì)互為前體和產(chǎn)物，其形成需要較長(zhǎng)的時(shí)間。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與成熟時(shí)間射線的夾角及投影反映了成熟時(shí)間因素對(duì)該揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)影響的相關(guān)性和大小。2,7-二甲基-5-羥基-4-辛酮、2-乙基-1-己醇、乙醇、十六醇、甲苯、乙酸乙酯含量與成熟時(shí)間之間為鈍角，所以呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。苯的含量與成熟時(shí)間呈正相關(guān)，且在成熟時(shí)間射線上的投影最長(zhǎng)，說(shuō)明苯與成熟時(shí)間相關(guān)性最強(qiáng)，對(duì)照組干酪隨著干酪成熟時(shí)間的延長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)從無(wú)到有的變化。其次是癸酸、丁酸和乙酸乙烯酯。

2.4.2 L. plantarum 1-2活菌數(shù)的影響

從圖6可知，相比干酪成熟時(shí)間對(duì)干酪揮發(fā)性風(fēng)味的影響，益生菌活菌數(shù)對(duì)干酪揮發(fā)性風(fēng)味的影響要小一些。各組干酪在益生菌添加量射線上的投影一致，說(shuō)明模型的合理性。

丁酸在益生菌添加量射線上的投影最長(zhǎng)，說(shuō)明丁酸受益生菌活菌數(shù)的影響最大，其次是乙酸。賴氨酸可生成丁酸和乙酸，這2 種物質(zhì)是切達(dá)干酪中重要的物質(zhì)，丁酸表現(xiàn)出汁味和干酪味，乙酸表現(xiàn)出蠟味[43]。乙醇、2,7-二甲基-5-羥基-4-辛酮、十六醇、2-乙基-1-己醇與益生菌添加量的射線呈鈍角，說(shuō)明這4 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與活菌數(shù)呈負(fù)相關(guān)。

2.4.3 L. plantarum 1-2添加方式的影響

干酪的加工過(guò)程中，排乳清過(guò)程降低了干酪的水分含量，一定量的微生物和酶隨乳清一同排出，此過(guò)程也會(huì)影響干酪成熟過(guò)程和產(chǎn)品的穩(wěn)定性[44]。益生菌添加方式對(duì)干酪揮發(fā)性風(fēng)味的影響與益生菌添加量對(duì)干酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響相似。由圖6可知，丁酸受益生菌添加方式的影響最大，其次是乙酸。乙醇、2,7-二甲基-5-羥基-4-辛酮、十六醇、2-乙基-1-己醇與益生菌添加方式呈負(fù)相關(guān)。益生菌干酪成熟12 周，丁酸含量最高達(dá)對(duì)照組的3.96 倍（P＜0.05）。

各組干酪在益生菌添加方式射線上的投影一致，并且益生菌干酪1和益生菌干酪2距離接近，這是因?yàn)橐嫔衫?和益生菌干酪2添加菌種的方式一致。對(duì)照組干酪和益生菌干酪3分布在益生菌干酪1和益生菌干酪2的兩側(cè)。

益生菌添加量和添加方式射線之間的夾角為銳角，說(shuō)明兩者呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.778 9。兩者與干酪成熟時(shí)間的相關(guān)系數(shù)為0.000 0。說(shuō)明兩者與成熟時(shí)間因素相互獨(dú)立。為了研究益生菌添加量和益生菌添加方式之間的相關(guān)性，以干酪中風(fēng)味物質(zhì)種類和含量為指標(biāo)聚類分析干酪樣品。由圖7可知，甲苯、乙醇、乙酸乙酯、2,7-二甲基-5-羥基-4-辛酮、3-甲基-1-丁醇、3-羥基丁二酮呈上調(diào)的趨勢(shì)，說(shuō)明干酪的風(fēng)味以這6 種風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)為主。3 種益生菌干酪按成熟時(shí)間（0、4、8、12 周）分布于4 個(gè)區(qū)域，但對(duì)照組干酪不同，成熟4 周的樣品和益生菌干酪成熟0 周的樣品聚為一類；成熟8 周的樣品和益生菌干酪成熟4 周的樣品聚為一類；成熟12 周的樣品和益生菌干酪成熟8 周的樣品聚為一類。說(shuō)明添加益生菌L. plantarum 1-2促進(jìn)了干酪的成熟。周蕊等[45]同樣得到植物乳桿菌可促進(jìn)干酪的成熟。不同成熟時(shí)期的益生菌干酪2和益生菌干酪3樣品都聚為一類，說(shuō)明在殺菌乳中添加9（lg（CFU/mL））益生菌L. plantarum 1-2與排乳清后在凝乳中添加8（lg（CFU/g））L. plantarum 1-2，對(duì)干酪風(fēng)味的影響一致。

圖7 干酪樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的熱圖Fig. 7 Heat map from cluster analysis of volatiles in cheese sample

3 結(jié) 論

本研究考察了益生菌L. plantarum 1-2活菌數(shù)及其添加方式、干酪成熟時(shí)間對(duì)切達(dá)干酪揮發(fā)性風(fēng)味形成的影響。氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)出30 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，添加益生菌改變了干酪中風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，與對(duì)照組相比增加了乙苯、十二烷、己醇和丙酮4 種風(fēng)味物質(zhì)。成熟時(shí)間對(duì)干酪風(fēng)味的影響最大，苯隨干酪成熟時(shí)間的延長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)了從無(wú)到有的變化。另外，風(fēng)味物質(zhì)中丁酸受益生菌活菌數(shù)和添加方式的影響最大。益生菌活菌數(shù)與干酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量呈正相關(guān)；相同成熟時(shí)間，活菌數(shù)越高，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量顯著增加或減少。在排乳清后添加益生菌（8（lg（CFU/g）））獲得了與在殺菌乳中添加高活菌數(shù)益生菌（9（lg（CFU/mL）））相似的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類與組成，表明適宜的添加方式可以降低益生菌用量、節(jié)約成本并獲得相似的產(chǎn)品品質(zhì)。本研究結(jié)果為在益生菌干酪加工中選擇適宜的益生菌添加方式及用量，提高益生菌干酪的品質(zhì)提供了理論支持。

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