胡柚汁益生菌發酵揮發性風味特征

束文秀，吳祖芳*，劉連亮，翁佩芳

（寧波大學海洋學院，應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211）

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡柚、白砂糖 市售；MRS固體培養基、MRS液體培養基 杭州微生物試劑有限公司；植物乳桿菌L1（Lactobacillus plantarum L1，Lp L1）、發酵乳桿菌L2（L. fermentum L2，Lf L2）由寧波大學海洋學院食品生物技術實驗室保存。

1.2 儀器與設備

MX-GX1011攪拌機 廈門建松電器有限公司；5417R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；QP-2010 Plus GC-MS聯用儀 日本島津公司；SPME裝置、二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取纖維頭 美國Supelco公司；微量進樣器（10 μL）美國安捷倫公司；GC-O嗅探器 荷蘭ATAS&GL公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的處理

挑選新鮮無蟲害的胡柚并清洗表面雜質，90 ℃水中煮10 min，再將煮過的胡柚去皮，去囊衣，去籽，得胡柚果肉，加水榨汁，經過濾獲得胡柚汁；向胡柚汁中添加白砂糖攪拌均勻，90 ℃滅菌15 min，冷卻至25 ℃；將不同乳酸菌發酵菌劑按3%接種后發酵，37 ℃發酵36 h；然后置于8 ℃冰箱中靜置12 h進行后熟，得到樣品。樣品分別為對照組（未接菌）、發酵組1（Lp L1）、發酵組2（Lf L2）、發酵組3（Lp L1∶Lf L2=1∶1）。

1.3.2 HS-SPME測定

將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在GC進樣口老化，老化溫度為270 ℃，載氣體積流量為1.2 mL/min，老化時間為1 h。準確移取10 mL樣品于25 mL螺口進樣瓶中，加入3.6 g NaCl，促進香氣成分的揮發，用聚四氟乙烯隔墊密封，于水浴鍋中平衡，平衡溫度為40 ℃，平衡時間為15 min。平衡后將SPME萃取頭通過隔墊插入進樣瓶，插入深度為1 cm，推出纖維頭，使纖維頭置于樣品瓶頂空進行吸附，吸附時間為40 min，隨后取出萃取頭，并立即將萃取頭插入GC儀的進樣口，插入深度為2 cm，推出纖維頭，解吸5 min，同時啟動儀器收集數據。

1.3.3 GC-MS聯用分析

GC條件：HP-5（5% diphenyl-95% dimethlpolysiloxane）彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；He流量為1.2 mL/min；無分流進樣；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min的速率升到160 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min的速率升至220 ℃，保持3 min[27]。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；燈絲發熱電流0.25 mA；電子倍增器電壓1 000 V；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；質量掃描范圍35～350 u。

1.3.4 電子鼻測定條件

徐天水今年六十多歲，是大徐莊老住戶。老兩口就一閨女，十幾年前到蘇州打工，談個外縣小伙子，徐天水死活不同意，誰知閨女更倔，硬是跟人跑了，讓徐天水在莊上挺丟人。老伴兒本來就是病病歪歪的，這下氣得更是成了藥罐子。

量取2 mL胡柚汁樣品于10 mL樣品瓶中，并加入用保鮮膜密封，靜置10 min后測量。采用頂空抽樣的方法用電子鼻進行檢測，檢測時間250 s，傳感器清洗時間200 s，電子鼻傳感器及其性能見表1。用穩定狀態下的信號進行分析，取70 s的信號作為電子鼻分析的時間點。每個樣品重復5 次。

表1 電子鼻對不同物質的響應類型Table1 Chemical sensors used in electronic nose corresponding to different types of volatile substances

1.4 數據統計

定性方法：揮發性風味物質成分實驗數據處理由GC-MS分析軟件系統完成，通過計算機譜庫（NIST/STEROL/Wiley）進行化合物的質譜鑒定，再結合文獻進行人工譜圖解析，檢測出揮發性成分匹配度大于85（最大值為100）的化合物，確定揮發性風味物質的各個化學組成。定量方法：按峰面積歸一化進行相對定量，計算揮發性風味物質的相對含量。利用SPSS 19.0對揮發性風味物質數據進行主成分分析。電子鼻的數據利用PEN3內部Win Muster軟件進行線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌發酵胡柚汁色譜分析與風味種類分析

圖1 不同胡柚汁樣品的總離子流圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatograms of grapefruit juice samples

利用HS-SPME-GC-MS對不同的胡柚汁樣品（對照組、發酵組1、發酵組2、發酵組3）進行分析，對總離子流色譜圖，如圖1所示，結合文獻最終確定各揮發性風味物質，面積歸一化法計算各物質的相對含量，結果如表2所示。

表2 胡柚汁樣品揮發性成分的鑒定結果Table2 Identification of the volatile components of grapefruit juice samples

續表2

如圖1所示，與對照組的總離子圖相比，接入不同菌種發酵胡柚汁的色譜圖區分明顯。3 種乳酸菌發酵樣品共鑒定出79 種揮發性風味物質（表2），其中醇類20 種、烯烴類15 種、烷烴類12 種、酮類10 種、醛類5 種、酯類2 種、其他類15 種，揮發性風味物質分別為59、36 種和35種。從揮發性成分種類的數量來看，胡柚汁經不同乳酸菌接種發酵后揮發性風味物質種類均增加，如圖2所示，與對照組相比，接種Lf L2揮發性物質增加了3 個，接種混菌增加了2 個，增幅并不大。從揮發性風味物質種類來看，與對照組相比，檢測到了新的種類為酯類化合物。

圖2 乳酸菌發酵胡柚汁揮發性風味物質的相對含量（A）和種類（B）Fig. 2 Volatile flavor composition of fermented grapefruit juice

2.2 乳酸菌發酵胡柚汁揮發性風味組分相對含量變化

由表2和圖2可以看出，胡柚汁經接種乳酸菌Lp L1發酵后，烷烴類化合物的總相對含量大量增加，達到33.48%，是對照組的33 倍，其中對照組中微量存在的八甲基環四硅氧烷相對含量增加顯著，相對含量達11.09%；檢測到許多對照組中未被檢測到的烷烴類物質，其中相對含量較高的為十甲基環五硅氧烷（11.00%）、六甲基環三硅氧烷（4.98%）和十二甲基環六硅氧烷（3.98%）；而對照組中相對含量最高的十一烷未被檢測到。醇類化合物總相對含量大量增加，是對照組的11倍，其中L-香芹醇相對含量提高至3.29%，其他共有成分相對含量均提高到一半以上，同時檢測到大量新的醇類化合物，其相對含量較高的為正己醇（2.53%）、柏木烯醇（1.32%）、1-庚醇（0.91%）和1-壬醇（0.68%），對照組中存在的β-小茴香醇未被檢測到。酮類化合物總相對含量大量增加，其中包括相對含量較高的新酮類物質如甲基壬基甲酮（0.79%）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（0.57%）和2-壬酮（0.45%），對照組中相對含量最高的1-戊烯-3-酮相對含量降低至0.40%，而對照組中存在的甲基庚烯酮和右旋香芹酮未被檢測到。烯烴類化合物的總相對含量大幅降低了52.96%，其中對照組中相對含量最高的左旋檸檬烯相對含量降低至26.96%，松油烯相對含量降低至1.01%，并出現了新的烯烴類物質苯乙烯和（E）-2,2-甲基-4-癸烯。醛類化合物的總相對含量降低了9.05%，2,4-戊二烯醛在對照組中相對含量最高，經Lp L1發酵后相對含量降低至0.07%，對照組中存在的除2,4-戊二烯醛和壬醛外均未被檢測到，檢測到對照組中不存在的苯甲醛。酯類化合物的總相對含量達到1.88%，其中甲酸甲酯（1.76%）的相對含量最高。其他類的總相對含量降低了0.09%，與對照組較為接近，其中甲基異丙基苯相對含量最高，與對照組相比，相對含量降低到1.46%。

Lf L2以及混菌接種后發酵汁中的風味成分相似，但與對照組和接種Lp L1發酵相比，風味物質差異顯著。烯烴類化合物總相對含量最高，與對照組相比，Lf L2和混菌接種分別降低了2.23%和2.24%，胡柚汁原料本身的特征烯烴類風味物質左旋檸檬烯、松油烯、月桂烯均被檢測到。醇類物質的總相對含量僅次于烯烴類化合物，2 種樣品的增幅都在4%的范圍內，經Lf L2發酵后出現新的醇類物質順-2-己烯-1-醇和順香芹醇，這2 個物質在Lp L1的發酵液中并未發現，混菌發酵液中存在Lf L2發酵液中不存在的環己醇。烷烴類化合物的總相對含量也顯著提高，分別為4.58%和3.90%，其中4 種樣品中所共有的八甲基環四硅氧烷相對含量最高，分別達到2.23%和2.16%，與另外2 個樣品比較相對含量差別較大；六甲基環三硅氧烷和十甲基環五硅氧烷在對照組中未被檢測到，而在Lp L1、Lf L2以及混菌發酵組中有檢測到，且相對含量均在0.5%以上。酮類化合物相對含量增加，除3-辛酮、甲基庚烯酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和左旋香芹酮外，其他檢測到的物質與Lp L1發酵組相似，1-戊烯-3-酮是4 種樣品所共有的，其相對含量在Lf L2以及混菌發酵組中均有所降低。醛類化合物相對含量分別降低了9.05%和9.65%。總體來看，乳酸菌發酵胡柚汁樣品中醛類物質相對含量大量降低，醇類、酮類和烷烴類相對含量顯著提高。與對照組相比，乳酸菌發酵后的胡柚汁的風味物質更加豐富。

2.3 主成分分析結果

利用SPSS 19.0軟件對4 種胡柚汁樣品中的91 種揮發性風味化合物進行主成分分析，所得的主成分的特征值和貢獻率如表3所示，所得的載荷矩陣圖如圖3所示。

表3 3 個主成分的特征值和貢獻率Table3 Eigenvalues of three principal components and their variance contributions and cumulative contributions

圖3 主成分載荷矩陣圖Fig. 3 PCA loading plot

以91 種風味物質的第1主成分載荷值為橫坐標，第2主成分的載荷值為縱坐標，由圖3可知，第1主成分中正影響揮發性物質載荷系數達到0.9以上有39 種，主要為醇類、烷烴類和酯類，這些成分與第1主成分有高的相關性，八甲基環四硅氧烷（0.999）、6-異丙烯基-3-甲基-1-環己烯-1-醇（0.993）、L-香芹醇（0.991）、六甲基環三硅氧烷（0.989）是第1主成分中正影響揮發性物質的典型代表；負影響揮發物質載荷系數達到0.9以上有10 種，大部分為烯烴類，甲基異丙基苯（0.999）、月桂烯（0.995）、左旋檸檬烯（0.995）、松油烯（0.993）是第1主成分中負影響揮發性物質的典型代表。第2主成分中載荷較高的正影響揮發性物質主要為醛類，壬醛（0.989）、1-戊烯-3-酮（0.971）、2,4-戊二烯醛（0.883）較高，與第2主成分有高度相關性；負影響揮發物質載荷較高的主要為酮類，其中2-庚酮（0.939）、2-壬酮（0.936）、左旋香芹酮（0.897）較高。第1主成分代表烯烴類、酯類、烷烴類、醇類和其他類，第2主成分代表酮類和醛類，將影響胡柚汁樣品風味的7 種物質降維到2 種主成分。烯烴類是4 種樣品所共有的，主要集中在第2、3象限內，是對照組、Lf L2和混菌發酵組中相對含量最高的揮發性成分。醛類主要集中在第3象限內，在對照組中相對含量僅次于烯烴類。除烯烴類外，Lp L1、Lf L2和混菌發酵胡柚汁的主要揮發性成分烷烴類和醇類，大部分集中在第1象限內。發酵樣品能夠在這2 個主成分中被區分開來，Lp L1主要揮發性物質集中在第1、2象限，Lp L2和混菌集中在第1、2、3象限，分布差異性顯著。

2.4 電子鼻分析結果

LDA是將高維的模式樣本投影到最佳鑒別矢量空間，投影后保證模式樣本在新的子空間有最小的類內距離和最大的類間距離的一種統計分析方法，能夠最大限度地區分不同的樣品集，降低數據空間維度。對4 種胡柚汁樣品進行電子鼻分析，并利用電子鼻自帶軟件對數據進行LDA，如圖4所示。

圖4 電子鼻檢測的LDA圖Fig. 4 LDA plot of electronic nose data

由圖4可知，LD1和LD2的方差貢獻率分別為57.53%和17.74%，兩判別式的總貢獻率達75.27%，能較好地反映總體信息。4 種樣品無重疊部分，數據點均分布在各自的區域內，能夠被很好地區分開來，說明電子鼻能較好地識別乳酸菌發酵胡柚汁樣品的香氣物質，4 種樣品的香氣之間差異性顯著。從各樣品兩兩之間的橢圓距離來看，未接種的胡柚汁樣品與接種乳酸菌的樣品距離較大，說明接種乳酸菌對胡柚汁香氣的影響較大；接種Lf L2和接種混菌的距離更為接近，說明這2 種樣品的風味更為接近，這與揮發性風味物質的檢測結果一致。

3 討 論

乳酸菌發酵胡柚汁的揮發性風味物質主要來源于胡柚原料的本身和乳酸菌發酵代謝的成分。烯烴類化合物閾值較低，多呈現果香和花香[28]，加熱易促使其分解，在3 種發酵樣品中相對含量豐富，除接種Lp L1外，與對照組相近；本實驗檢測結果左旋檸檬烯是胡柚汁原料所特有的呈味物質，這與洪鵬等[29]研究3 種柚子精油最主要的成分均為檸檬烯和β-月桂烯的結果一致，烯烴類化合物也是發酵組的主要呈味物質。醛類化合物多為果香及花香，閾值較低，賦予香氣能力較強[28]。高含量的醛類物質可能會引起異味[30]。對照組中醛類物質相對含量較高，原因可能是胡柚汁在接菌之前進行了高溫的處理，加熱過程可能導致醛類物質的增加[24]，如對照組中有檢測到的戊醛具有煮熟的風味[30]。乳酸菌發酵后代謝分解了大部分醛類物質，Lp L1發酵組中檢測到的苯甲醛具有櫻桃味和甜味，對風味起到加強作用。醇類通常具有芳香、植物香，其閾值一般很低，對風味的形成有不容忽視的作用。胡柚汁發酵后醇類物質的種類均增加，正己醇、1-庚醇是乳酸菌發酵所獨有的，接種Lp L1醇類物質增加明顯，可能與Lp L1的代謝特性有關。醇類一般由相應的醛通過脫氫酶催化的還原反應形成，乳糖的代謝、甲基酮的還原、氨基酸的代謝都可生成相應的醇，特別是在乳酸菌的作用下，這些反應更加強烈[31-32]。酯類是一類影響風味的重要化合物低分子質量的酯類一般具有芳香氣味或特定水果香味[33]，發酵組均發現了對照組沒有的酯類物質，這是由于酯類物質是在乳酸菌的作用下由醇類和有機酸等生成的一類化合物[34]。酮類化合物香味優異持久，一般貢獻花香和果香風味[31]，其閾值要高于其同分異構體醛，其中不飽和酮類具有較高的揮發性[29]。乳酸菌發酵后酮類物質增加，對風味起到加強作用，且隨著菌種不同增加的種類和相對含量不同，原因可能是酮類物質是氧化反應的最終產物，而乳酸菌的加入對氧化反應起到促進作用。烷烴類主要來源于脂肪酸烷氧自由基的斷裂[35]，由于香味閾值較高，對胡柚汁風味的貢獻較小，為Lp L1發酵的主要揮發性風味物質。對樣品香氣成分的電子鼻檢測并結合LDA方法可對發酵胡柚汁樣品揮發性風味差異性的判別，與GC-MS分析結果具有較好的互補性。

從單一菌種與混合菌種發酵產物差異性結果比較，個別組分在單菌種發酵未能檢出（如3-亞甲基-6-（1-甲基乙基）環己烯）而混合菌發酵中產生，或者在混合菌發酵中未能檢出（如2,4-戊二烯醛）而單菌種發酵中檢測到，這可能是由于不同的2 種菌其所含酶系的差異性及其代謝特性存在差別，相比單菌種發酵，混合菌發酵體系中，一種菌的代謝產物可能是另一種菌的代謝底物，同時也存在發酵產物間或發酵底物與產物之間等復雜的反應。相似機理已有相關文獻報道，例如，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的互惠共生作用，保加利亞乳桿菌代謝產物氨基酸為后者提供氮源，也為后者提供嘌呤類物質和嘌呤類物質前體[36]等。混合菌發酵品質組分的差異性的機制有待進一步通過基因組學、代謝組學等手段進一步闡明。

4 結 論

胡柚汁經接種乳酸菌（Lp L1、Lf L2和混合菌）發酵后其揮發性風味物質分別為59、36 種和35 種，揮發性風味化合物的種類均增加，并產生了新的風味物質酯類，醛類物質相對含量顯著降低，醇類、酮類和烷烴類相對含量顯著提高。通過乳酸菌發酵后風味物質得到了調整并呈現一定協同效應，使胡柚汁的果香與乳酸菌的發酵香渾然一體，賦予了發酵胡柚汁獨特的風味。主成分分析選取了2 個主成分代表4 種樣品92.53%的原始信息，其中八甲基環四硅氧烷、甲基異丙基苯、月桂烯、6-異丙烯基-3-甲基-1-環己烯-1-醇、L-香芹醇、壬醛、1-戊烯-3-酮和2-庚酮對揮發性風味物質相對含量影響較大，找出了影響4 個樣品的特征風味組分在主成分中的差異，表明主成分分析法可實現對益生菌發酵胡柚汁特征風味差異性的評價。電子鼻分析表明乳酸菌發酵胡柚汁后風味改變顯著，LDA能夠區分出4 種胡柚汁樣品存在顯著性差異，且不同乳酸菌發酵胡柚汁其風味也有較顯著的差異。

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