從枝菌根真菌在土地工程中的應用研究

文/張宸 陜西地建房地產開發有限責任公司 陜西西安 710075 陜西省土地工程建設集團有限責任公司 陜西西安 710075

1、前言

作為一項實際要求較高的實踐性工作，從枝菌根真菌在土地工程中的應用有著其自身的特殊性。該項課題的研究，將會更好地提升對從枝菌根真菌在的分析與掌控力度，從而通過合理化的措施與途徑，進一步優化該項工作的最終整體效果。

2、概述

植物內生真菌（endophytefungi）是非常重要的微生物資源，幾乎所有植物組織內都存在內生真菌，其發酵產物具豐富的化學多樣性和廣泛的生物活性。自Strierle等發現紅豆杉的內生真菌紫衫霉可產紫杉醇后，引發了利用內生真菌來替代原植物的研究熱潮。很多植物中都發現了能夠產和宿主相同結構的活性次生代謝產物的內生真菌，如白喉烏頭根部的內生真菌芽枝狀枝孢（Cladosporiumcladosporioides）可產烏頭堿。為保護黃草烏野生植物資源，緩解我國中藥資源日益減少與需求量不斷增加之間的矛盾，本研究對黃草烏根部的內生真菌進行了分離與鑒定，為黃草烏的中藥資源保護和開發利用提供新思路。

3、材料與方法

3.1 材料與試劑

黃草烏新鮮健康植株于2015年10月采集于云南省昆明市盤龍區，由昆明醫科大學楊淑達副教授鑒定，標本（2015-yc-1）保存于云南大學化學科學與工程學院。葡萄糖、瓊脂粉、NaClO購于上海泰坦科技股份有限公司，青霉素及卡那霉素購于阿拉丁，酒精購于天津化學試劑有限公司。

3.2 內生真菌的分離與培養

3.2.1 分離培養基PDA培養基：去皮馬鈴薯200g煮沸30min，加入葡萄糖20g，瓊脂粉12g，紗布過濾，濾液定容至1000mL，pH自然，121°C滅菌30min。

3.2.2 分離與培養黃草烏的根用自來水沖洗干凈，截成6～8cm長條，晾干水分后于5%NaClO溶液漂洗60s，無菌水沖洗三次，然后于75%酒精漂洗60s，最后無菌水沖洗三次則表面消毒處理完畢。無菌狀態下將根切成2mm3小塊，置于分離平板培養基（28±1）°C靜止培養，培養基需預先加入青霉素（100mg/L）和卡那霉素（100mg/L）以抑制細菌生長。3～7d后培養基中可見菌落形成，挑取組織周圍的菌落轉接入PDA斜面。采用平板梯度稀釋法純化分得的內生真菌，根據其主要菌落形態特征（菌落大小、顏色、表面特征和質地）和菌體個體形態特征（菌絲、子實體和孢子形態），按微生物分類的不同將同一類群進行歸類。最后將已純化和歸類的菌株分別轉入PDA斜面，在（28±1）°C下培養。

3.3 內生真菌的鑒定

采用插片培養方法對分離的內生真菌進行顯微形態特征的觀察、鑒定，在顯微鏡下觀察子實體特征，結合培養特性，將菌株鑒定到屬。然后依據不同屬的分類標準，參照文獻的方法進行種的鑒定。

3.4 分子生物學信息分析

在PDA平板上恒溫培養內生真菌5d后在無菌條件下用刀片刮取菌絲至1.5mL離心管收集菌絲體。在研缽中用液氮充分研磨菌絲體至粉末狀，立即裝入1.5mL離心管中，用真菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA，置于-20°C冰箱中保存備用。提取基因組DNA后，用引物ITS4進行擴增，擴增產物交由昆明碩擎生物科技有限公司進行測序，測序結果進行Blast比對。

結果：

子囊菌門的菌株在綱、目、科、屬等分類水平上具有豐富的多樣性，分離鑒定的真菌包括子囊菌門的4綱、7目、9科、16屬，其中地絲霉屬（Geomyces）和漆斑菌屬（Myrothecium）在科的水平上未分類。屬于接合菌門的菌株僅有4株2種，都為接合菌綱毛霉菌目毛霉菌科毛霉菌屬。另外有4株3種的真菌屬于擔子菌門，分布于擔子菌門的1綱、2目、3科、3屬中。在綱的分類水平上，糞殼菌綱有24株，占分離總數的46.2%，包括10屬13種。其次為散囊菌綱，有15株，包括2屬12種。在目的分類水平上，優勢目為肉座菌目，具有18株9種的內生真菌，其次為散囊菌目，有15株12種。叢赤殼科和發菌科為黃草烏的優勢菌群，分別有14株6種和15株12種。從屬的層面上看，鐮刀菌屬共分離得到12株4種，是黃草烏內生真菌的優勢屬種；其次是青霉菌屬，有11株9種，曲霉屬有4株3種。

討論：

本研究所得黃草烏根部的內生真菌類群普遍被認為腐生性較強，但是所采集的樣本全部來自健康植株，宿主未表現受到傷害或感染病害的癥狀，應該不會給腐生性真菌提供生長基質。因此認為這些真菌是內生的或至少是部分內生且不引起植物病害，它們符合植物內生真菌的有關定義。本研究還發現鐮刀菌屬是黃草烏根部內生真菌的優勢屬種，在本實驗中分離得到的4種鐮刀菌屬的真菌：腐皮鐮刀菌、燕麥鐮刀菌、三隔鐮刀菌、尖孢鐮刀菌均被報道能引起植物病害，可以認為是潛伏的致病菌。本研究中亦從黃草烏中分離得到芽枝狀枝孢，該菌曾被報道可產生二萜生物堿類化合物烏頭堿，本研究所分離得到的芽枝狀枝孢是否能在一定的培養條件下產生二萜生物堿則有待進一步研究。

結語：

綜上所述，加強對從枝菌根真菌在土地工程中應用的研究，對于其良好實踐效果的取得有著十分重要的意義，因此在今后的從枝菌根真菌應用工作過程中，應該加強對其關鍵環節與重點要素的重視程度，并注重其具體實施措施與方法的科學性。