應用現代分子生物學技術檢測農產品質量安全的現狀與發展趨勢

李金娟

（甘肅省農業科學院畜草與綠色農業研究所，甘肅省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，甘肅蘭州 730070）

中國是一個人口大國，也是一個農業大國。農產品質量安全是關系到國計民生和國家可持續發展的重大問題。隨著科學技術的快速發展，農業生產和加工逐漸向產業化和工業化發展，由此而引發的農產品質量安全問題不容忽視，農產品質量安全檢測技術的研究與發展顯得尤為重要。目前，我國已逐步建立起農產品質量安全檢測網絡，極大地推動了我國農業經濟發展[1]。盡管如此，農產品質量安全仍然是公眾及媒體熱切關心的話題，也面臨著極大的挑戰。農產品質量安全檢測技術是保障和監控農產品質量安全的重要技術支撐，也是關鍵的制約因素。因此，農產品質量安全檢測技術提高及檢驗檢測體系能力建設顯得更為迫切，將先進技術應用于農產品質量安全檢測，建立各種快速、準確、可靠的檢測方法，提高檢驗檢測效率，有效保障農產品從生產到進入市場全過程安全，是農產品質量安全檢測工作提高和發展的必經之路，也是夯實農業質量安全工作的基礎。

農產品質量安全檢測技術的檢測對象主要是針對影響農產品質量安全的農產品環境指標（包括土地指標、大氣指標、水質指標等）中農獸藥、重金屬等化學危害因子以及微生物、寄生蟲、生物毒素等生物危害因子[2]。然而，由于檢測對象種類繁多，組成結構復雜，動態、痕量、濃度波動范圍大，并且樣品基質復雜，干擾因子多，使得農產品質量安全檢測技術研究具有復雜性[3]。傳統化學檢驗檢測技術因具有費工時、耗資大，常伴有試劑、溶媒污染，同時破壞對象物原有化學結構等問題，已不能滿足于現代農產品質量安全監測控制發展的需求，而形態學觀察、生理生化、酶抑制法、免疫分析法和培養基篩選等檢測手段存在靈敏度低、假陽性、特異性差和效率低等明顯缺點。近年來，隨著生命科學與其交叉學科的發展，以及生物信息學、計算機技術的應用，分子生物檢測技術作為一種基因水平的檢測技術，因其具有快速靈敏、特異性好、響應快等優點而在農產品質量安全方面逐漸得以應用，成為保障農產品質量安全不可或缺的重要技術支撐。針對分子生物檢測技術的研究和發展成為新時期農產品質量安全的戰略制高點之一，也備受農產品質量安全領域的關注與重視。

1 農產品質量安全檢測技術發展中存在的問題

1.1 農獸藥殘留及農產品檢測技術存在局限性 我國農產品質量安全工作在檢測技術上存在著很大問題。近年來，我國農產品質量安全檢測技術正在提升，根據相關研究數據表明，我國農產品農獸藥檢測技術水平已有極大的提高，農獸藥殘留及多項藥物與添加劑等均可檢出，并且制定了確定的檢驗檢測標準。快速檢測技術也在市場中獲得了很大的成功，市場占比逐年提高。然而，盡管如此，我國農產品質量安全工作在檢測技術上仍然存在很多問題。例如，農獸藥殘留方面仍有許多種類無法進行檢測；農產品品質、內源營養物及產地環境污染物質無法進行檢測；我國檢驗檢測設備主要依靠進口而缺乏自主研制研發的檢測儀器與設備，從而無法具有針對性的進行檢測；現有快速檢測技術產品的靈敏性差，快檢儀器設備穩定性低，存在著跟多問題等。

1.2 農產品質量安全風險評估缺少檢測數據 我國對農產品質量安全檢測工作缺少風險評估數據。就風險評估技術而言，我國對農產品中存在的化學物質進行了檢測，主要建立了階梯式的暴露評估和累積性的膳食暴露評估2種風險評估方式。然而，我國,農產品質量安全風險評估基礎數據不夠完善，毒理學、危害因素本底含量等方面的數據嚴重缺乏，無法滿足對農產品質量安全風險評估的市場需求。真菌毒素對農產品污染的風險評估便急需數據支撐。真菌毒素（Mycotoxin）是真菌在食品或飼料里生長所產生的代謝產物，毒性非常高，對農作物及其產品及飼料等植物源性產品都造成了污染，對人類和動物同樣有害。目前已發現的真菌毒素有200余種，可通過被其污染的谷物和飼料喂養的動物性產品（如奶、肉、蛋等）進入食物鏈，進而成為農產品質量安全的危害因子危害人類健康。真菌毒素的共同毒性主要表現在可導致DNA損傷和細胞毒性兩方面[4]。黃曲霉素、伏馬霉素、棕曲霉毒和玉米烯酮等許多真菌毒素一般在較低水平下的慢性毒性比其急性毒性更值得關注。究其原因在于某些真菌毒素確定有潛在致癌性，媒體對其進行了廣發報道，但是因為食品中真菌毒素的完全去除是不可能的，所以應用快速可靠的毒素檢測技術將其控制在對健康不構成威脅的安全水平內就顯得尤為重要。然而，分子生物檢測技術作為一種快速可靠、靈敏性強的檢測技術因仍然停留在發展階段而尚未被納入風險評估的內容中。因此，我國農產品質量安全風險評估工作缺少大量確實的數據，評估的樣板嚴重缺乏[5]。

1.3 農產品產地環境溯源方面缺乏技術提升 近些年，我國在產地溯源技術上取得了一定的成就，建立了穩定的同位素法、DNA標記法及近紅外反射光譜法等等多項產地溯源技術和方法。然而，我國現有的溯源體系僅限于產地信息記錄方面，缺乏與產品品質、加工等相關的溯源技術，亟待形成完整的產地溯源體系。其中，重金屬作為一類有毒且難以降解并具有潛在危害性的農產品產地環境污染物而備受關注。重金屬污染具有隱蔽性、不可逆和長期性，在農畜產品中均存在不同程度的殘留。現已知具有很大毒性的重金屬至少20種，其經食物鏈的生物放大作用侵入人體，長期積累則導致各種“公害病”乃至癌癥等，是影響人類健康的嚴重污染物質。

1.4 農產品加工過程中細菌污染與非法添加物檢測缺乏標準體系 我國是一個農產品生產與加工的大國，而農產品加工過程中極易受有毒細菌等的污染，同時色素、防腐劑、保鮮劑等成分超量違規添加的現象在其生產、加工制作及流通的各個環節中普遍存在。國際上對于農產品加工產業都采用國際統一標準或者較嚴格的國家（地區）標準進行生產。此標準體系的建立與實行對我國也顯得尤為重要。

2 分子生物學檢測技術在農產品質量安全中的應用現狀

2.1 分子生物學檢測技術在農產品農獸藥殘留檢測中的應用 目前，用于農獸藥殘留的主要快速檢測技術為化學、免疫學及酶抑制技術。化學檢測技術主要用于有機磷的檢測，但是該方法僅限于土壤、果蔬中的有機磷檢測且靈敏度差。分子生物檢測技術（包括酶聯免疫技術、RT-PCR技術、生物傳感器、基因差異顯示技術、生物芯片和基因探針等）以其高靈敏性和特異性而成為國內外農產品質量安全研究的熱點。作為分子生物檢測技術中發展最為迅猛的酶聯免疫技術（ELISA）和PCR技術已逐漸成為農獸藥殘留檢測中最快速有效的主流檢測方法，也是色質譜之外特異性最強的方法。

酶聯免疫技術（ELISA）是由分子免疫技術結合現代測試手段而建立的一項微量檢測技術。因其靈敏性強，特異性好而成為農獸藥殘留污染物檢測中應用最廣的分子生物學技術[6]。斑點酶聯免疫吸附試驗（DOT-ELISA）、親和素生物素系統ELISA（ABC-ELISA）、雙夾心酶聯免疫吸附試驗（DS-ELISA）等則是在其基礎上而衍生出來的檢測方法。由其研發制成的試劑盒在食品、蔬果和產地環境中已被大量應用于農獸藥殘留的測定分析，可檢測包括有機磷、有機氯、氨基甲酸酯類在內的大量農藥，其中硫和磷含量的檢測靈敏性和特異性最佳。Singh[7]等應用ELISA試劑盒對12個農場區域的茄子樣品中的硫的含量進行了測定，與氣相色譜法比較之后發現二者之間的相關性達到了0.98。除此之外，用抗體磁顆粒ELISA法對水中的西維因進行檢測，測定范圍為0.22～0.25 μg/L，檢測結果與液相色譜法的檢測結果同樣表現出了極好的相關性。

2.2 分子生物檢測技術在農產品真菌毒素檢測中的應用 目前，傳統的真菌毒素檢測方法基本都必須經過前增菌、平板選擇性分離、生物化學和血清學分型鑒定4個步驟。整個檢測工作量大、周期長、成本高，且依靠主觀判斷，所以導致檢測數據準確性低，靈敏性差。因此，作為現代快速檢測技術的分子生物學技術在真菌毒素檢測中的應用則備受關注。目前，應用于真菌毒素檢測的分子生物學檢測技術主要包括有兩種方法，分別為包括酶聯免疫、免疫擴散法、免疫傳感器法及免疫色譜法等在內的免疫學方法，以及以核酸為研究基礎的分子生物學方法，后者則主要有核酸探針法和PCR法。PCR法因其高靈敏性和特異性而更具優勢，已成為真菌毒素檢測的優勢技術。PCR（全稱聚合酶鏈式反應）技術是一種在體外模擬生物體細胞內DNA復制過程而對特定DNA序列進行快速擴增的分子技術。其具有快速、特異性強、靈敏性高的優點，是分子生物學領域的又一次革命性的突破，其發展與更新速度極快。隨著交叉學科的發展，分子生物學技術有了更多元化的發展，新的PCR檢測技術方法層出不窮。例如：PCR-基因掃描、等位基因特異性擴增技術（Allele-specific PCR）、套式引物PCR技術、競爭PCR（C-PCR）技術和反轉錄PCR（RT-PCR）技術等。

近些年，PCR技術已廣泛應用于農產品中真菌毒素的快速檢測。Babu等[8]建立了免疫磁珠捕獲Real Time PCR技術對黃曲霉毒素B1進行了檢測，分別利用單克隆抗體直接夾心和多克隆抗體間接夾心免疫PCR檢測，結果表明單克隆抗體捕捉的直接夾心法是最佳方法，其檢測范圍 為 0.1～10 .0 μg/L，相關性為0.97，效能為 99.5%，這就為應用免疫-PCR檢測農產品中低分子抗原奠定了一定的基礎。He等[9]則建立了免疫-PCR技術用于檢測牛肉、牛奶及生雞蛋中的蓖麻毒素，結果表明牛肉、牛奶、生雞蛋的 檢測 限， 免 疫 -PCR技術分別為100、10、10 pg/mL，而 傳 統 ELISA 法 分 別 為 103、103、104 pg/mL。Rajkovic等[10]對 含 1% 牛 血 清 蛋 白（BSA，Bovine Serum Albumin）的 磷 酸 鹽 緩 沖 液（PBS,phosphate buffer solution） 及 半 脫脂牛奶中的肉毒桿菌神經毒素（botulinum neurotoxins，Bo NT），A、B分別采用LISA和定量免疫-PCR法進行了檢測，結果表明Bo NT/A的檢測限用ELISA檢測分別為 15、30 ng/mL，檢 測均為 0.09 ng/mL；Bo NT/B 的檢測限用ELISA檢測分別為15、30 ng/mL，用定量免疫-PCR分別為 0.37、0.75 pg/mL。Leenalitha等[11]采 用 了 免 疫 -PCR 信號放大技術對牛奶、檸檬奶油派、金槍魚沙拉及火雞中的金黃色葡萄球菌腸毒素分別進行了檢測，其檢測限均低至7.5 fg/mL。

2.3 分子生物檢測技術在產地環境及農畜產品中殘留重金屬檢測中的應用 目前實驗室常用的重金屬檢驗檢測方法主要有：石墨爐原子吸收光譜法，X射線熒光光譜法和ICP-AES等，雖然能準確測量出樣品中單個金屬總量，但是耗時多，預處理過程復雜，測量結果無法反應出重金屬氧化還原狀態的變化或其狀態演變的信息。進而對重金屬污染普查和風險評估工作造成很大的不確定性。近些年，國內外對重金屬快速檢測技術的研究很多，其中研究較為成熟且已應用的有免疫學檢測技術、酶抑制法以及生物傳感器技術。免疫學檢測技術已成功應用于水質樣品中銦(Ⅲ)、汞(Ⅱ)、鎘(Ⅱ)、鉛(Ⅱ)和鈾(Ⅵ)等的檢測。重金屬酶抑制法指的是利用脲酶抑制法對土壤和水質樣品中的汞的測定，但也集中在環境中水樣及液體樣本的快速檢測。針對固體樣品中重金屬的快速檢測，目前研究并可應用的則是生物傳感器技術。利用lac Z和ars D基因在大腸桿菌重組質粒中的表達可制成具有高靈敏度的生物傳感器，可用于檢測重金屬亞銻，結果表明亞銻鹽的檢測限為 1×10-15mol/L。基于光合系統Ⅱ的原理，利用重金屬殼模擬葉綠素分子中的Mg2＋反應引起pH值變化的性質，研發制成了生物傳感器，將藻細胞固定在瓊脂（濃度2%）中，由pH值測定值的變化來測定重金屬鉻和鎘的含量。

2.4 分子生物檢測技術在農產品加工過程檢測標準體系建立中的應用 針對農產品加工過程中有毒細菌污染的檢測同真菌毒素的污染檢測，分子生物學技術同樣可達到快速、特異性強、靈敏性高的檢測目的。農產品加工過程中超標、違規添加物品種繁多，結構復雜，但依其特性可歸類為農獸藥殘留、化學藥物殘留、真菌毒素、重金屬污染等，根據上文所述，分子生物學技術仍然是較為理想的快速準確的檢測方法。

3 展望

農產品質量安全是關系到國計民生的大事，因此有關農產品質量安全中的農產品品質分析、質量控制和產地環境檢測都對檢測技術提出了更多更高的要求。近幾年，以ELISA法、PCR法、生物傳感器及免疫學檢測技術等為代表的分子生物學技術憑借其無可比擬的高靈敏性在農產品質量安全及農業環境檢測中都得到了迅猛的發展，已獲得了國際范圍內的廣泛關注與研究，檢測速度、檢測范圍和檢測限都得到了極大的提升，且正在向便攜、高通量、具“類特異性”的方向發展，因此分子生物學技術應用于農產品質量安全檢測已成為發展的趨勢。

雖然分子生物學檢測技術在農產品質量安全檢測上具有廣闊的發展前景，但同時也存在著一定的局限性。例如，目前酶抑制法、免疫分析技術還在定性和半定量的發展階段，檢測室常規檢測中還未完全取代常規氣相色譜和高效液相色譜的方法；ELISA法雖然在農獸藥檢測中高效、快速、靈敏，但由于其抗體制備較為困難、缺乏共用試劑且還不適于多項殘留的分析，所以未完全應用于農產品質量的檢測。因此，密切關注和了解國內外最新研究發展動態，盡可能縮短最新技術在農產品質量安全檢驗領域中的應用周期，把科學技術轉化為生產力。在檢測室現有傳統檢測技術的基礎上，結合多種分子生物學技術運用于農產品質量安全檢測，形成特異性強、靈敏性高、快速、便捷和高效的農業質量安全檢測體系將會是今后研究的重要發展趨勢。