沙眼衣原體免疫層析法應用研究進展

顧偉鳴

（上海市皮膚病醫院檢驗科，上海 200443）

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是一種細胞內寄生的微小微生物，分為小鼠生物型、沙眼生物型和性病淋巴肉芽腫生物型，后2種與人類疾病有關，可引起人類泌尿生殖道感染，如男性尿道炎、附睪炎，以及女性宮頸炎、盆腔炎、宮內感染等，孕婦生殖道感染Ct可導致新生兒眼炎和肺炎[1]。世界衛生組織估計每年有1.31億新感染者[2-3]。美國疾病與預防控制中心2016年報告Ct新發病例達159萬例，較2015年增長了4.7%[4]。我國105個性病監測點報告生殖道Ct感染發病率由2008年的32.48/10萬增長到2015年的37.18/10萬，年均增長1.95%[5]。生殖道Ct感染已經成為全球重要的公共衛生問題之一[2-5]。

1 Ct檢測方法

Ct感染是我國國家監測病種之一。由于Ct感染的潛伏期長、臨床表現和癥狀不典型，主要以實驗室檢測結果作為臨床診斷依據。Ct檢測方法主要有3種：細胞培養法、分子生物學方法和免疫學方法。細胞培養法是傳統的“金標準”，然而其操作復雜，需要高水平的專業技術人員，目前僅有少數實驗室進行科學研究時采用。隨著現代分子生物學理論和檢測技術的進步，分子生物學方法無論在敏感性還是特異性方面，都超越了細胞培養方法和免疫學方法，被認為是替代的“金標準”。但是從實驗室技術能力和質量監管的角度看，開展分子生物學方法需要技術準入門檻和特定的實驗室及設備條件，短時間內無法在基層醫療機構普及。而免疫學方法，尤其是免疫層析法檢測技術，由于操作簡便、檢測周期快、特異性較好等優勢，在全國各地不同級別的醫療機構中普遍開展。截止到2018年3月，國家食品藥品監督管理總局的網站顯示有3種檢測衣原體抗體和10余種檢測衣原體抗原的免疫層析法試劑盒，1種直接免疫熒光法試劑盒。本文主要介紹以抗原為靶標的Ct免疫層析法檢測技術的特點和應用價值。

2 免疫層析法分類

免疫層析技術（immunochromatography assay，ICA）是20世紀80年代初發展起來的一種基于抗原抗體特異性免疫應答的檢測技術，對細胞或樣本中的多糖、糖蛋白、蛋白質、多肽、激素和核酸等生物大分子進行定位及定性檢測，匯集了免疫檢測、標記、層析等綜合學科技術。根據示蹤標記物將ICA分為免疫膠體金技術（immune colloidal gold technique，ICGT）和免疫乳膠技術（immune latex technique，ILT）。

ICA按層析過程液體流動方向分為垂直流向的免疫滲濾分析（dot immunofiltrtion assay，DIFA）和水平流向的免疫層析分析（dot immuno-chromatography assay，DICA）。免疫層析將已知靶標的特異性抗體（單抗或多抗）包被于硝酸纖維素膜上的特定位置作為檢測帶（T），可捕獲免疫復合物的二抗包被于臨近位置作為質控帶（C），標記了示蹤顆粒的特異性抗體（單抗標記結合物）附于樣品滴加墊上并干燥。檢測時，樣本中的水分可溶解單抗標記結合物，若樣本中有待測抗原，則會發生抗原抗體反應，形成的免疫復合物A（標記抗體-抗原）借助毛細管作用向吸水墊方向移動，到達T位置時，被特異性抗體捕獲形成復合物B（標記抗體-抗原-包被抗體），在T位置聚集形成肉眼可見的免疫復合物條帶；若樣本中無待檢抗原，則不能形成肉眼可見的免疫復合物條帶。游離的標記抗體或復合物A越過T到達C，與二抗發生反應，形成復合物D（標記抗體-二抗）或復合物E（復合物A-二抗），聚集并產生肉眼可見的免疫復合物條帶，提示檢測有效。

2.1 ICGT

ICGT是以膠體金作為示蹤標記物檢測抗原的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸在還原劑如白磷、維生素C、枸櫞酸鈉或鞣酸等的作用下，聚合成為穩定、特定大小、膠體狀態的納米金顆粒。球形的納米金顆粒對蛋白質有很強的吸附能力，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而被應用于定性或半定量的快速免疫檢測。

2.2 ILT

ILT以紅色乳膠微球作為示蹤物來標記抗體，制成特異性試劑。由羧基修飾的聚苯乙烯微球表面呈高度疏水性，與配體最大程度結合。乳膠微球被清洗、稀釋和活化后，利用1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺和乳膠微球上的羧基耦合形成一個O-異酰基脲結構，這一活化中間物與抗體上的-NH2基團形成酰胺交聯，再利用N-基琥珀酰亞胺形成更穩定的交聯產物，被用于定性或者半定量衣原體抗原檢測。

3 Ct-ICA臨床應用

Ct- ICA采用抗衣原體脂多糖單克隆抗體檢測Ct。由于是針對衣原體屬的抗原，理論上檢測陽性結果涵蓋了所有衣原體屬的感染。從性傳播感染（sexually transmitted infection，STI）流行病學特征來看，引起泌尿生殖道感染的主要是Ct D～K血清型，以及在我國少見的可引起性病性淋巴肉芽腫的L血清型[1]。

鑒于Ct抗原檢測的樣本為泌尿生殖道的分泌物，含有較多未知蛋白和雜質，因此泌尿生殖道Ct的檢測試劑采用雙抗體夾心ICA。隨著現代即時診斷（point-of-care testing，POCT）標記技術和放大技術的飛速進步[6]，臨床普遍采用Ct-POCT開展常規的診療，世界衛生組織推薦在高危人群中采用POCT篩查STI，以期達到早期診斷、及時治療、阻斷傳染源的目的[7]。

2006年，美國國家生物醫學影像和生物工程研究所提出了一項全國性倡議：POCT對于解決資源緊張地區和貧窮國家性傳播疾病的流行具有巨大的潛力[8]。ROMPALO等[9]在2008年3月—2009年4月對美國馬里蘭州巴爾的摩市和俄亥俄州辛辛那提市的STI患者進行定性檢測，檢測快速、操作簡便和結果易于讀取的POCT得到了他們的青睞。POCT具有更好的保密性、隱私性和便利性，不僅方便家庭使用，也可以應用于臨床，醫生可以根據陽性結果立即開展治療。2010年4月—2011年2月在巴爾的摩市招募了154名婦女進行衣原體檢測，Ct-POCT的敏感性達到92.9%，測試成本為33.48美元，比核酸擴增技術（nucleic acid amplification technique，NAAT）更高效，費用更低[10-11]。HSIEH等[12]對218名美國性病專科醫生進行的調查結果表明，POCT是性傳播疾病門診首選的檢測方法，而檢測的敏感性是性病專科醫生關心的首要問題。

我國Ct-POCT的臨床應用始于20世紀90年代初，由于衣原體感染問題日益受到重視，進入21世紀后，特別是近年來，我國放開“二孩”政策，育齡婦女的生殖道Ct感染關乎下一代健康問題[13]，Ct-POCT無論在普及范圍還是在使用數量方面，都達到了前所未有的程度。但是大量臨床實踐表明，Ct-ICA檢測敏感性低的問題逐步成為我國衣原體感染診斷重要的影響因素。臨床評估發現，一個進口品牌Ct-ICA試劑檢測女性宮頸樣本的敏感性只有49.3%[14]，而另外一個進口品牌Ct-ICA檢測男性尿道樣本的敏感性僅57.14%[15]。DOMMELEN等[16]在2008年對772位女性的自采樣本進行檢測時發現，以核酸檢測方法為參照，3個品牌Ct-ICA的檢測敏感性為12%～27%。HISLOP等[17]發現Ct-ICA檢測宮頸樣本的敏感性為39%～65%，檢測男性首段尿樣本的敏感性為47%～77%。HUPPERT等[18]系統分析了4個國際知名Ct-ICA品牌的9份臨床評估報告中5 287例女性宮頸樣本，結果顯示：在女性人群中，這4種Ct-ICA檢測試劑的檢測敏感性為25%～95%。

隨著現代生物醫藥技術的進步，一種改良Ct-ICA的檢測敏感性有了很大程度的提升[19]，采用脂多糖抗原優勢表位嵌合重組蛋白誘導衣原體種屬特異性抗體，其中1個抗體用于固相包被，2個抗體標記膠體金探針，通過增加衣原體抗原捕捉能力達到提高檢測敏感性的目的。有研究結果表明，改良Ct-ICA檢測女性高危人群的敏感性接近聚合酶鏈反應，檢測男性高危人群的敏感性為73.2%[19]，比蔣娟等[15]的研究結果提升了16%，而在低危人群中，改良Ct-ICA的檢測敏感性與聚合酶鏈反應仍然有較大差距[19]。另一項對英國1 349例性病門診女性患者采用Ct-ICA進行檢測的研究結果表明，同樣以核酸檢測做為參比方法，Ct-ICA的檢測敏感性高達81.6%～83.5%[20]。

以往的臨床應用評估有以下特點：（1）不同報道的應用評估研究時間跨度近30年，正處于免疫標記技術和生物工程技術快速發展的階段，Ct-ICA試劑質量不可同日而語；（2）研究對象有高危和/或低危人群，每項研究的樣本量差異懸殊，敏感性為25%～95%。提示Ct-ICA適用范圍具有局限性；（3）每項研究都是采用一種待評估Ct- ICA試劑與細胞培養法和/或核酸檢測法相比較的方式，其中一些研究僅僅是臨床檢測結果的回顧性分析。沒有1項研究是在相同背景下對不同Ct-ICA試劑進行的平行評估；（4）對于不同研究人群，Ct-ICA抗原檢測的特異性都超過95%。提示Ct-ICA檢測特異性好，但敏感性因試劑品牌和檢測人群不同而差異較大。

4 結語

綜上所述，泌尿生殖道Ct-ICA是各級醫療機構普遍采用的方法，特別是對高危人群的檢測在防控衣原體感染蔓延工作中有著重要的價值。隨著生物醫藥技術革命性的進步，Ct-ICA試劑質量有了較大的提高。但由于試劑的原料和生產工藝等因素影響，不同品牌Ct-ICA試劑檢測性能差異較大，目前為止未發現關于Ct-ICA的系統性評價。我們在性病檢測室間質評中也發現了不同品牌檢測試劑敏感性差異顯著的問題。有必要制定專門的Ct-ICA檢測性能的評估方案，以系統了解我國Ct-ICA現狀，推薦臨床適用范圍和路徑。