PRKAG2基因突變與心臟的關系

胡海鷹 張必利 綜述 鄭興 審校

(1.第二軍醫大學長海醫院心內科，上海 200033； 2.武警江西總隊，江西 南昌 330000)

自2000年人遺傳性心肌病相關基因——PRKAG2基因成功定位后，人們對于該基因的功能研究不斷深入，該基因的點突變可引起不同程度的臨床表現，引發了人們的極大興趣，現對該基因的研究現狀做一綜述。

1 PRKAG2基因概述

PRKAG2基因定位于染色體7q36，包含16個外顯子，30萬個堿基，編碼569個氨基酸，相對分子質量約為6.3×104。它編碼腺苷單磷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)γ2亞基，人類心臟組織中以此亞基形式存在。AMPK是細胞能量感受器，是調節細胞合成和分解代謝信號途徑中主要的組成成分。AMPK由催化亞基α、調節亞基β和γ以異源三聚體的形式存在[1]，各亞基又有多種亞型(α1/α2、β1/β2、γ1/γ2/γ3)，不同組織的AMPK由不同的亞型聚合而成，其中γ亞基正是AMPK感受細胞能量的感應器。

PRKAG2基因包含4個胱硫醚β-合成酶(CBS)基序，它們串聯形成Bateman結構域，N-末端接有一延長區域。翻譯成蛋白后，CBS基序對稱存在，類似扁平的圓盤，理論上可產生4個配體結合位點，能結合核苷酸AMP、ADP或ATP；但其中的CBS2不能結合核苷酸，可能是因為缺乏結合腺嘌呤核苷酸的天門冬氨酸殘基[2]。

當細胞能量缺乏時(AMP/ATP比值上升)，AMP結合到γ2亞基Bateman區域，誘發α亞基激酶區的一個特異性蘇氨酸殘基Thr172位點磷酸化，從而激活AMPK，最終開啟分解代謝途徑以生成ATP，并關閉需消耗ATP的合成代謝途徑，以此來維持能量的動態平衡[3-4]。高濃度的ADP與AMP作用相似，激活AMPK；而ATP作用相反[5]。Willows等[6]在細胞水平的研究顯示γ2的N末端區域也可通過影響Thr172去磷酸化從而調節AMPK活性。

2 PRKAG2基因突變與臨床表型

2001年，Gollob等[7]報道了PRKAG2基因突變與家族性心室預激(或WPW綜合征)、傳導系統異常及心肌肥厚發病有關。隨后相繼發現多個家系存在不同的PRKAG2基因突變，并全部或部分出現上述臨床表型。該基因突變主要表現為心臟功能紊亂，典型特征是：心室預激、進展性心臟傳導功能障礙、心肌肥厚以及心肌細胞糖原過量沉積，被定義為PRKAG2心臟綜合征，屬于代謝性心肌病，少數患者可出現骨骼肌異常等心臟外病變；確診該病有賴于基因檢測。該病雖類似肥厚型心肌病；但與之不同的是，PRKAG2心臟綜合征無心肌纖維化，無肌節排列紊亂。PRKAG2心臟綜合征雖然罕見，但經家系分析顯示呈常染色體顯性遺傳，故一旦發生，可累及多名家系成員。目前，國內外報道的PRKAG2基因突變至少有16種，含1種移碼突變Leu351Ins和15種錯義突變，分別為：Glyl00Ser、Arg302Gln、Ser333Pro、Val336Ala、His383Arg、Arg384Thr、Thr400Asn、Lys475Glu、Tyr487His、Asn488Ile、Glu506Lys、His530Arg、Arg531Gly、Arg531Gln、Ser548Pro[2,8-16]。不同的突變位點導致的臨床表型輕重不一，而即使是同一突變，家族成員的臨床表現也各有差別。其中Arg531Gly突變可使受累患者在兒童期即出現嚴重癥狀，而Arg384Thr和Arg531Gln突變甚至可導致患者在出生后數周內死亡，最終只能通過尸檢確定致病原因，是迄今報道最嚴重的類型。

3 PRKAG2基因的功能研究現狀

PRKAG2基因突變分布于全身，但僅心臟受累，這可能是因為人類心肌中主要表達γ2亞型[17]。該突變是如何引起糖原沉積、心室預激、心肌肥厚或心臟傳導功能障礙的？人們通過在哺乳動物細胞和轉基因小鼠中過表達PRKAG2基因突變得到了初步的認識，近期又有基因敲入(knock-in)小鼠和人誘導多能干細胞培養的心肌細胞水平的研究，拓展了人們對該基因的功能認識。

在轉基因小鼠水平，不同位點PRKAG2基因突變得出的結論并不一致。Sidhu等[10]研究Arg302Gln突變發現AMPK活性顯著減少；而Arad等[11]發現Asn488Ile突變導致AMPK活性增高；Banerjee等[12]則發現Thr400Asn心肌中AMPK活性存在雙相變化，早期激活，隨后降低，最后恢復到野生型水平。因此，有學者提出PRKAG2基因突變導致AMPK活性失調(抑制或活化)是PRKAG2心臟綜合征的發病機制。

Burwinkel等[18]研究表明，在哺乳動物細胞CCL13中過表達α1β1γ2異源三聚體后，Arg302Gln、His383Arg、Thr400Asn、Arg531Gly突變可同時降低AMPK-γ2對AMP、ATP的親和力，降低程度依次遞增。而在人胚胎腎臟293細胞中，過表達Arg531Gly和Arg531Gln突變，雖顯著降低了AMP、ATP的親和力，完全阻斷了AMP異構激活AMPK的作用，仍可增加AMPKα亞基上的Thr172位點磷酸化水平及其活性。

雖然在轉基因小鼠中過表達人γ2突變確實誘導出了類似人的一些關鍵疾病特征，且采用相同啟動子的野生型γ2小鼠作為對照進行研究，但畢竟γ2是過表達的，因此被人詬病。為消除過表達的干擾，近來，研究者建立了三株類似人Arg302Gln、Asn488Ile、Arg531Gly突變的knock-in小鼠模型[19-20]。結果顯示，所有三株小鼠的肝臟或肌肉組織的AMPK基礎活性增高。Asn488Ile、Arg531Gly knock-in小鼠出現了心室預激；Arg531Gly小鼠心臟糖原含量大幅增加，心臟重量也是增加的；但Asn488Ile小鼠無此表現。相比之下，Arg302Gln knock-in小鼠無明顯心臟表型。其結果與之前過表達突變的研究結論有差別。

由于Arg531Gly、Arg531Gln和Arg384Thr突變誘發了該病極嚴重的臨床表現，這引起了研究者極大興趣，認為上述突變對AMP和ATP結合γ亞基具有最顯著的影響，對它們的認識有助于詮釋疾病的發展轉歸。研究發現，Arg531和Arg384分別位于CBS4、CBS2，但也影響AMP或ATP結合γ亞基關鍵位點CBS3。Cheung等[13]在Arg531Gly和Arg531Gln突變中發現，AMP結合γ亞基減少降低了AMP激活AMPK的作用，是一種功能喪失效應；但ATP結合減少可增加AMPK活性，是一種功能增益效應，且功能增益占優勢，正是這種活性增加引起了大多數病癥；而出現功能喪失效應可能是因為研究種屬差異引起的，因在嚙齒類動物的心臟中主要亞型是γ1。

鑒于在臨床表現最重的Arg531Gln突變細胞水平研究中發現AMPK活性是增高的，Salt等[2,18]更傾向于支持γ2突變后引起AMPK活性升高，即功能增益效應是PRKAG2心臟綜合征的發病機理。這也可以解釋為什么會出現糖原沉積？AMPK可促進心肌攝取葡萄糖，其活性增加可導致葡萄糖攝取增加，這種情況在細胞并不需要葡萄糖供給時也會發生。在轉基因小鼠心臟中過表達Asn488Ile突變，證實了這種推測，該模型可誘導出類似人的心室預激和心肌肥厚[21]。在第50天時，實驗組的心臟糖原比對照組增加了20倍，同時伴有葡萄糖攝取增加和糖原合成增加，而乳酸產物減少，這說明糖原合成增加是由葡萄糖攝取增加所致，而非源自糖酵解。當Asn488Ile轉基因突變小鼠與攜帶糖原合酶對葡萄糖-6-磷酸不敏感的突變knock-in小鼠雜交時，Asn488Ile突變小鼠的高糖原表型及心室預激均被逆轉[22]；但心肌肥厚仍存在，說明前者是繼發于糖原含量升高，而后者不是。Hinson等[23]在人誘導多能干細胞分化的心肌細胞(iPS-CMs)的研究表明，PRKAG2基因突變通過激活AKT信號通路，提高了糖原含量，最終使心肌細胞增大，與小鼠模型結論一致。而糖原沉積是葡萄糖代謝調控的結果，因轉錄水平富含葡萄糖代謝的關鍵調控因子。研究發現編碼糖原合酶及其亞型的轉錄產物升高，且隨著糖原磷酸酶、磷酸果糖激酶和葡萄糖轉運蛋白的變化而改變，后者又與穩態下代謝組學和葡萄糖代謝動力學的改變相平行。研究還發現，線粒體生物合成因子如過氧化物酶體增殖物激活受體α和γ輔激活因子1α增加，與線粒體含量升高和呼吸作用增強相符。

糖原含量異常可導致心室預激。胚胎發育過程中，心房和心室隨著纖維環的形成而被分隔，以確保房室腔的唯一電傳導是通過房室結。在Asn488Ile轉基因突變小鼠中發現[21]，這一纖維環變薄并斷裂，心肌細胞內的糖原空泡破壞了胚胎發育過程中纖維環形成，引起了心房和心室之間的異常電傳導。另一項研究也發現[23]，PRKAG2突變小鼠模型中纖維環發生異常形態改變，其機制可能為激活的AMPK降低了轉化生長因子(TGF)-2β生成，而受TGF-2β信號通路調控的纖維環形成因此出現異常，誘發心室預激。

Kim等[22]證實，通過逆轉AMPKγ2 Asn488Ile轉基因小鼠的糖原沉積，可消除心室預激；但仍存在心肌肥厚，表明心肌細胞增殖不依賴于糖原沉積，有其固有的激活機制。這一作用可能是通過增加心肌細胞的胰島素敏感性以及激活Akt-mTOR-FOXO3A路徑介導的。不同于肥厚型心肌病引起的左室肥厚，PRKAG2心臟綜合征引起的左室肥厚無心肌纖維化的表現，iPS-CMs模型的研究表明這可能是由于TGF-β信號通路減弱引起[23]，iPS-CMs可表達豐富的TGF-2β，AMPK參與了TGFβ-2轉錄后調控。此外，在Asn488Ile突變小鼠中發現雷帕霉素復合物-1的靶蛋白信號通路高度激活，正常情況下AMPK抑制這一信號通路，有研究表明，AMPK可在特定情況下通過提供氨基酸形成自噬而激活雷帕霉素復合物-1的靶蛋白。當Xu等[8]在細胞水平研究中用雷帕霉素治療Lys475Glu突變，細胞增殖及肥大被有效逆轉；而在Asn488Ile突變小鼠中并不能完全預防，說明還有其他機制參與心肌肥厚的發生。

Wolf等[24]研究Asn488Ile轉基因突變小鼠發現，其體表心電圖顯示PR間期縮短、QRS波變寬。與心肌工作細胞比較，心臟傳導系統細胞糖原含量更高，易于受到糖原沉積的影響。這也許是臨床上部分患者需安裝起搏器植入治療的原因之一。一項在大鼠心室肌細胞中過表達AMPKα1突變的膜片鉗研究[25]顯示，鈉離子通道開放狀態失活速率減慢，動作電位時程延長。其機制可能是AMPK通過磷酸化作用調節鄰近閏盤的心肌細胞膜離子通道的密度和功能狀態來完成。研究者推斷PRKAG2突變的患者也可能受此影響。而其他離子通道如鈣通道是否受突變影響還未知。

此外研究[20]還發現，在高脂飼養條件下，Arg531Gly knock-in小鼠出現了腎臟功能受損伴糖原沉積，腎囊腫形成、炎癥和細胞凋亡。Arg302Gln knock-in小鼠純合子隨著周齡增大表現出明顯的肥胖，而雜合子此表現較弱。肥胖可能是因為生長素水平升高促進了食物攝入，而生長素是通過下丘腦的Ca2+/鈣調蛋白依賴激酶途徑激活AMPK進行調節的。通過Ca2+/鈣調蛋白依賴激酶磷酸化Thr172激活AMPK表明存在一種即使沒有能量需求也能通過升高細胞內Ca2+激活AMPK的機制[26-27]。總之，這種knock-in小鼠顯示出心臟外表型。有趣的是，在研究了上述小鼠模型后人們也關注到，人攜帶Arg302Gln突變的雜合子，相比于未受影響的同胞，心臟表型相對輕，存在非心臟表型特征：如肥胖增加，空腹葡萄糖和糖化血紅蛋白水平增高，胰島素水平降低等。

4 PRKAG2心臟綜合征的治療

除了在傳統的藥物、小分子[28]、起搏器植入、射頻導管消融、心臟移植等對癥治療層面的探索，近期在轉基因和knock-in小鼠的研究中，Xie等[29]通過基因編輯技術如規律成簇的間隔短回文重復工具糾正His530Arg突變，其結果令人振奮：心臟擴大、糖原空泡和沉積均被逆轉，而心肌肥厚和心功能恢復至正常水平。這為人們治療顯性遺傳性疾病提供了一種新的手段。

5 小結和展望

目前人們的研究主要集中于PRKAG2基因突變導致AMPK活性改變的信號通路，結合當前研究熱點人誘導干細胞技術誘導多能干細胞培養的心肌細胞的興起，其結論將更接近人的病理生理。迄今PRKAG2基因突變電生理的相關研究較少，對心肌細胞離子通道的研究尚不全面。由于PRKAG2心臟綜合征屬于單基因遺傳疾病，結合基因編輯技術，未來有可能治愈該病。

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