具有人紅細胞重建的人源化小鼠模型構建和應用的研究進展

范 偉，楊永廣，胡 正

(吉林大學第一醫院轉化醫學院/免疫學研究所，吉林 長春130061)

小鼠作為一種常用的模式動物在醫藥領域具有廣泛的應用。早在17世紀小鼠就被作為實驗對象，現已成為使用量最大、研究最詳盡的哺乳類實驗動物之一。然而，許多藥物或治療方案在普通小鼠模型中驗證有效之后，在臨床試驗中卻有超過80%的失敗率[1]。小鼠和人之間巨大的進化差異是導致普通小鼠模型無法準確反映人生理和病理情況，并預測藥物的臨床療效的主要原因。因此，構建能夠直接反映人類生理、病理狀況的新型小鼠模型對于生物醫學研究的進步具有重要意義，而人源化小鼠就是在這種環境下應運而生[2]。具有人造血免疫系統的人源化小鼠即造血免疫系統人源化小鼠，是目前最為成熟且應用最為廣泛的一類人源化小鼠模型。

1 造血免疫系統人源化小鼠模型及其人紅細胞發育情況

1988年McCune等[3]將人的胎肝造血干細胞、胚胎胸腺及淋巴結移植入重癥聯合免疫缺陷(SCID)小鼠中建立了第1個人源化小鼠模型，即SCID-hu小鼠。同年8月，PBL-SCID小鼠模型誕生，該小鼠是將人外周血單個核細胞輸注入SCID小鼠中再造出人類免疫系統[4]。SCID小鼠的T細胞和B細胞幾乎完全缺陷，但小鼠自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)等其他天然免疫細胞還會高效殺傷人類細胞，嚴重影響基于SCID小鼠構建的人源化小鼠中人細胞的水平[2]。1995年NOD/SCID品系小鼠成功建立，NK細胞殺傷功能明顯降低且巨噬細胞幾乎不排斥人類細胞，是用于構建人源化小鼠模型的理想小鼠品系[5]。Lan等[6]通過在NOD/SCID小鼠上移植人胚胎胸腺和肝臟及造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSC)構建了具有人免疫系統功能的人源化小鼠模型，又被稱為BLT模型，被認為是活體研究人免疫系統及人免疫系統相關疾病的最優動物模型之一，已經被廣泛應用于生物醫學研究的許多領域[7]。在NOD/SCID小鼠基礎上進一步發展出的NOD/SCID IL2rg-/-小鼠的NK細胞完全缺陷，被認為是目前用于人源化小鼠模型構建的最佳受體之一[2]。

2005年 Ishikawa等[8]通過臉靜脈給新生NOD/SCID IL2rg-/-小鼠注射人臍帶血CD34+細胞，構建了具有人T細胞、B細胞和樹突狀細胞(dendritic cell,DC)等免疫細胞的人源化小鼠模型，且在其外周血中檢測到人Glycophorin A+紅細胞。研究[9]顯示：基于NOD/SCID小鼠和NOD/SCID IL2rg-/-小鼠建立的所有人源化小鼠的外周血中均無法檢測到人紅細胞，但其骨髓中卻有大量人紅系細胞，骨髓中未成熟的人紅細胞的嵌合比例和人白細胞嵌合比例幾乎無差別；但成熟人紅細胞嵌合比例卻遠低于人白細胞的嵌合比例，表明某些因素阻礙了人源化小鼠模型中人紅細胞的重建。

2 造血免疫系統人源化小鼠人紅細胞發育障礙的原因

2.1 網狀內皮吞噬系統不兼容本課題組前期研究[9]表明：小鼠網狀內皮系統的吞噬是導致人紅細胞無法在免疫缺陷小鼠中存活的主要原因之一。應用脂質體包載的氯膦酸二鈉(clodronate-liposome,CLD-liposome)清除小鼠巨噬細胞可以提高輸注免疫缺陷小鼠中的人紅細胞的生存時間，注射CLD-liposome的人源化小鼠的外周血中檢測到Glycophorin A+CD71—無核的成熟人紅細胞，聯合應用人白細胞介素3(interleukin-3,IL-3)和促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)能明顯提高人紅細胞的重建比例[10-11]。但外周血中網織紅細胞占人紅細胞比例的10%～30%，明顯高于正常人外周血中網織紅細胞的比例[10]。這可能與巨噬細胞完全清除有關，因為紅細胞的發育成熟脫核的過程需要巨噬細胞的參與，且巨噬細胞分泌的自身合成的鐵蛋白能夠促進紅細胞的成熟和分化[12]。由于缺乏可用的動物模型和有效的實驗檢測手段，紅細胞去核機制仍存在爭議。

2.2 CD47-信號調節蛋白α(Sirpα)信號通路的異常CD47是一類廣泛表達于細胞表面的蛋白分子，可調節具有吞噬功能免疫細胞(如巨噬細胞和DC)的吞噬作用。CD47與其配體Sirpα結合會傳導一個“Don’t eat me”的免疫抑制信號[13]，在異種移植中，由于供者CD47與受者Sirpα之間的不匹配導致移植物被受體巨噬細胞排斥[14]，可能限制了人細胞在小鼠中的重建。NOD背景的免疫缺陷小鼠比較特殊，與其他品系小鼠比較，人CD47與NOD小鼠的Sirpα親和力高出65倍，其原因是NOD小鼠的Sirpα在1結構域中缺少2個氨基酸，所以NOD背景小鼠比其他品系小鼠有更好的植入背景[15]。在NOD/SCID小鼠中1∶1轉輸CD47KO小鼠紅細胞及人紅細胞后，NOD/SCID小鼠排斥人紅細胞的速度明顯快于CD47KO小鼠，說明NOD/SCID小鼠排斥人紅細胞不是因為CD47-Sirpα信號通路缺失[11]。隨著對紅細胞發育研究的深入，報道[16]指出：CD47在衰老和氧化紅細胞上的表達水平及膜上分布出現異常，會促進巨噬細胞對紅細胞的吞噬，推測小鼠吞噬人紅細胞可能與人紅細胞在小鼠體內被氧化或快速衰老有關。

2.3 補體的調理作用目前應用于人源化的受者小鼠多為NOD背景的免疫缺陷小鼠，該小鼠優勢不僅在于其Sirpα與人CD47有交叉反應，而且該種小鼠補體系統不健全。NOD背景小鼠補體C5缺陷，因此不能形成膜攻擊復合體介導溶細胞效應[17]。一般認為，NOD/SCID及NOD/SCID IL2rg-/-小鼠的補體系統不會介導對植入人細胞的排斥。研究[18]表明：NOD背景免疫缺陷小鼠中的補體C3可以在無抗體的情況下直接結合并調理人紅細胞，介導小鼠吞噬細胞(包括巨噬細胞、中性粒細胞和內皮細胞)對人紅細胞的排斥作用；在CLD-lipsome處理的人源化小鼠中，聯合注射眼鏡蛇毒因子(Cobra venom factor，CVF)(清除小鼠補體C3)能夠將人源化小鼠外周血中人紅細胞的重建水平提高約2倍,說明人紅細胞在小鼠體內被清除與小鼠補體有關。

2.4 小鼠淋巴造血因子和人細胞交叉反應缺失紅細胞在骨髓中的分化發育依賴一系列細胞因子作用完成，例如IL-3和EPO[19]。研究[20]表明：小鼠IL-3和人IL-3之間的同源性較低，無法作用于人類細胞。EPO在低氧條件下由腎臟產生，調節紅細胞的產生[21]，其小鼠和人之間的交叉反應也不明確。研究[22]表明：通過給人源化小鼠高壓注射含有人IL-3和EPO基因的質粒，4周后可在人源化小鼠外周血中檢測到少量人紅細胞重建。與此類似，在CLD-liposome處理的人源化小鼠體內同時注射人IL-3和EPO可以將人紅細胞的嵌合比例提高約5倍[9]。因此，小鼠和人之間淋巴造血因子交叉反應缺失或不足也是限制人源化小鼠中人紅細胞重建的原因之一。

2.5 骨髓微環境造血干細胞在骨髓中向紅細胞分化發育除了與淋巴造血因子有關外，也與骨髓基質細胞等提供的骨髓微環境有直接關系[23]。小鼠骨髓微環境與人骨髓微環境不盡相同，所以人造血干細胞的一些屬性無法在人源化小鼠中體現，例如人造血干細胞無法在免疫缺陷小鼠中實現連續移植。人造血干細胞較小鼠造血干細胞在小鼠骨髓造血龕(Niche)的競爭劣勢也被認為是影響人源化小鼠骨髓中人造血干細胞定向分化的原因之一[24]。c-kit基因屬于酪氨酸激酶受體蛋白家族的重要成員之一，通過與干細胞因子(stem cell factor,SCF)結合激活一系列信號通路，參與造血干細胞增殖分化的調控。c-kit基因某些突變(如c-kit/W41)會導致自身造血干/祖細胞對造血龕提供的SCF(c-kit的配體)的作用能力減弱，降低小鼠造血干細胞對自身造血龕的競爭能力[24]。因此，c-kit/W41突變的免疫缺陷小鼠(如NSGW41)可以在非照射條件下直接注射人HSC實現較高水平人造血免疫細胞的重建[24]。在NSGW41背景的人源化小鼠骨髓中多個分化階段人紅系細胞(包括Pro-E、Int-E/Late-E和Retic/RBC)的嵌合比例均明顯高于基于NSG的人源化小鼠，與人骨髓中的紅系細胞組成情況十分相似[25]。Fiorini等[26]利用NBSGW小鼠對人紅細胞在各發育階段的形態分析、表面表型等方面進行充分表征，結果表明：優化小鼠骨髓中人造血干/祖細胞的骨髓微環境，有助于人紅細胞的分化發育。

3 具有人紅細胞組成的人源化小鼠模型的構建

按照模型構建的方法劃分，紅細胞人源化小鼠模型的構建方法大致可分為3類：模型Ⅰ，通過注射CLD-liposome等試劑抑制人紅細胞免疫排斥建立的模型[9]；模型Ⅱ，通過高壓注射含有人IL-3和EPO基因質粒促進人紅細胞骨髓分化建立的模型[22]；模型Ⅲ，通過反復注射大量人紅細胞抵消小鼠吞噬反應建立的模型[27]。

3.1 通過注射CLD-liposome等試劑抑制人紅細胞免疫排斥所建立的模型吞噬細胞對人紅細胞的排斥是導致人源化小鼠中人紅細胞缺陷的最主要原因之一。因此，在造血免疫系統人源化小鼠體內，經尾靜脈注射小劑量CLD-liposome即可實現約4%的人紅細胞重建[11]。聯合應用CLD-liposome和CVF可將外周血人紅細胞重建的比例再提高約1倍[18]。中性粒細胞也是一類具有吞噬能力的免疫細胞，CLD-liposome無法清除中性粒細胞，因此研究者通過注射抗中性粒細胞的抗體來阻斷中性粒細胞的吞噬作用[10]，聯合CLD-liposome也可以提高外周血中人紅細胞的重建。另外，在CLD-liposome處理小鼠體內注射人細胞因子IL-3和EPO能實現較高水平的人紅細胞重建(約25%)[22]。該模型優勢在于由人造血干細胞發育而來的人紅細胞能更好地模擬紅細胞的正常生理狀態，且人免疫系統與紅細胞為同一供者來源。

3.2 通過高壓注射含有人IL-3和EPO基因質粒所建立的模型紅細胞分化發育所需細胞因子信號缺失或不足是人源化小鼠中人紅細胞發育效率低的原因之一[22]。直接注射可溶性細胞因子IL-3和EPO有利于人紅細胞的生成，但需多次給藥，操作較為復雜。因此可通過構建含有人IL-3和(或)EPO基因的表達質粒[22]，利用高壓注射的手段將其注入人源化小鼠體內，使小鼠細胞大量表達并分泌該細胞因子，以供人紅細胞分化發育所用[22]。但是，由于單獨高壓注射IL-3/EPO質粒并未克服小鼠吞噬細胞對人紅細胞的強烈排斥作用，人源化小鼠中人紅細胞的重建水平較低(1%～4%)[10]。

3.3 通過輸注過量人紅細胞抵消小鼠吞噬反應所建立的模型該方法需要頻繁輸注人紅細胞來維持小鼠體內紅細胞水平，多用于瘧疾感染模型[28]。該模型的缺點是其外周血中人紅細胞來源于回輸入小鼠體內的成熟人紅細胞而不是由小鼠骨髓中的人造血干細胞分化而來，因此無法用于研究人紅細胞的分化發育過程以及相關疾病(如遺傳導致的貧血)；另外，該方法操作較為復雜，需要每天注射大量人紅細胞以維持人紅細胞水平[27]。

4 具有人紅細胞組成的人源化小鼠模型的應用

紅細胞是血液中的主要成分，主要負責氧氣運輸。據估計，成年人每秒能產生240 000個新生紅細胞。而如此大量的人紅細胞更新主要依賴于極少量定居于骨髓的造血干細胞通過紅細胞造血(erythropoiesis)過程實現[29]。該過程中微小的基因異常均可能導致嚴重的血液系統疾病，例如β-地中海貧血和鐮刀狀紅細胞貧血等，目前除了異體骨髓移植外并無有效的根治方法[30]，而異體骨髓移植會帶來嚴重的不良反應，如移植物抗宿主疾病(GVHD)。近年來，以胚胎干細胞和誘導干細胞為代表的干細胞技術取得了突飛猛進的發展。2008年Lu等[31]利用胚胎干細胞在體外分化出無核成熟的紅細胞；2017年Sugimura等[32]將人多能干細胞分化成人造血干細胞，其能夠在人源化小鼠體內分化成脫核的人紅細胞。另一方面，以CRISPER-Cas9技術為代表的基因編輯技術也使通過基因編輯根治遺傳性貧血成為可能[33]。具有人紅細胞重建的人源化小鼠模型為上述技術的開發和臨床轉化應用提供了理想的研究和檢驗平臺[11]。

人紅細胞可成為某些病原微生物(如瘧原蟲)的侵襲對象[34]。迄今為止，針對瘧疾的有效疫苗仍然未研制成功[35]。由于瘧原蟲感染具有宿主特異性的特點，傳統實驗動物無法模擬人類瘧原蟲感染。目前研究瘧疾多選用感染嚙齒類動物的瘧原蟲感染小鼠或大鼠，間接研究人類瘧疾感染機制及治療策略，無法準確反映瘧疾患者的實際情況[36]。Chen等[27]研究瘧疾感染過程結果顯示：人NK細胞優先與被感染的紅細胞相互作用，從而清除被感染的紅細胞。該模型的缺點是人紅細胞為異體來源，且需要反復、大量注射，小鼠巨噬細胞會不斷吞噬輸入的人紅細胞(包括被瘧疾感染過的人紅細胞)，與人體內情況也不相同。因此，建立具有穩定、高水平人紅細胞重建的造血免疫系統人源化小鼠模型對人瘧疾感染的機制研究和新藥開發具有重要意義。

5 展 望

具有人紅細胞重建的人源化小鼠模型的開發對于人紅細胞相關疾病的研究具有重要意義，但其發展長期遠遠落后于具有免疫系統重建的人源化小鼠模型[7]。經過近些年的研究，已逐漸明確了人源化小鼠中人紅細胞缺陷的原因，初步實現了成熟人紅細胞在人源化小鼠模型中的重建[9,18]。然而，上述模型并未得到廣泛應用，主要原因是小鼠巨噬細胞以補體C3非依賴方式排斥人紅細胞的機制仍不清楚，而克服小鼠巨噬細胞排斥所需注射的CLD-liposome對免疫缺陷小鼠具有較大毒性。因此，進一步明確免疫缺陷小鼠巨噬細胞排斥人紅細胞的機制、有針對性地阻斷該排斥作用是建立具有長期、穩定水平人紅細胞重建的人源化小鼠模型的關鍵。隨著人紅細胞排斥機制研究的深入和特異性抑制人紅細胞排斥方法的出現，紅細胞人源化小鼠模型將被更多地應用于人紅細胞相關疾病的研究中，促進人紅細胞相關新型療法的轉化應用。