米非司酮對稽留流產患者血清和絨毛組織中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6表達水平的影響

鄭 燕，王 娜，吳命坤，劉靜喬，孟亞麗

(河北醫科大學第一醫院婦科，河北 石家莊 050031)

稽留流產是指胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔內不能及時自然排出，是流產中的一種特殊類型[1]。導致稽留流產發生的人群主要有室外職業者、初產婦、自然流產病史患者、貧血和乙肝病毒攜帶者，環境因素和其他未知因素也是稽留流產發生的重要原因[2]。研究[3-5]表明：在妊娠過程中，受精卵著床到胎盤形成過程與新血管的生成有密切關系，血管生成素(angiopoietin，Ang)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)參與該過程。對于稽留流產的治療，目前臨床上主要以米非司酮聯合米索前列醇終止妊娠，該方法具有臨床療效好和藥物不良反應少等特點[6]。目前對米非司酮終止稽留流產的具體機制尚未明確，關于Ang和VEGF在稽留流產患者血清中的表達和相關性研究較少。本研究通過觀察米非司酮對68例稽留流產患者血清和絨毛組織中Ang-1、Ang-2和VEGF表達水平的影響，并檢測細胞因子腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)的表達情況，闡明米非司酮終止稽留流產的作用機制，為臨床上應用米非司酮終止稽留流產提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年3月—2017年3月在本院就診的孕10～16周的稽留流產患者68例作為藥流組，年齡20～39歲，停經10～16周。納入標準：①年齡20～40歲，平時月經規律；②夫妻雙方染色體核型無異常；③經B超檢查提示胚胎已停止發育，胎死宮中，子宮體積均不同程度小于孕周；④無內分泌異常；⑤無血栓形成傾向；⑥排除免疫因素和感染因素影響。選擇自愿要求終止妊娠的孕10～16周正常妊娠者51例為對照組，年齡20～38歲，停經時間10～16周。納入標準：①年齡20～40歲，平時月經規律；②既往正常分娩史且無不良孕產史；③此次孕期無腹痛、陰道流血和其他不適，未保胎治療；④B超檢查提示胎兒存活，子宮大小與孕周相符。均自愿要求終止妊娠。所有入選者血尿常規、肝功能和凝血功能正常，無子宮畸形及其研究對象內外科并發癥，無米索前列醇應用禁忌證。以上研究對象在年齡、孕周、孕次和產次等方面比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 分組和給藥 對照組研究對象于手術前1 d抽取靜脈血，第2天采用常規負壓吸引流產，手術后收集靜脈血和絨毛。藥流組患者給藥前1 d抽取靜脈血，于第 2天19：00、第3天7：00、19：00分別口服給予米非司酮50 mg，第4天8：00口服給予米索前列醇600 μg，于同一天抽取靜脈血，觀察宮縮、妊娠物排出情況、陰道出血量和不良反應等，孕囊排出后即刻收集絨毛。

1.3 樣本的采集及制備 收集研究對象靜脈血后，靜置30 min，3 000 r·min-1離心15 min，取血清，-20℃保存。收集患者絨毛組織后，采用生理鹽水沖洗，10%甲醛溶液固定1 d 后，常規脫水，采用石蠟包埋，制作4 μm連續切片，切片于60℃下烤片2 h后行免疫組織化學染色。常規脫蠟水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗；采用羊血清工作液封閉非特異性抗原修復；分別加入Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6一抗，對照組切片以PBS代替一抗，4℃過夜。室溫孵育40 min后加入生物素標記的羊抗兔二抗IgG和底物；二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明、封片。Ang-1、Ang-2和VEGF試劑盒由北京博奧森生物科技有限公司提供，TNF-α和IL-6試劑盒由武漢博士德生物工程公司提供。

1.4 ELISA法檢測血清中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6水平 取患者血清，采用 ELISA 法檢測血清中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6水平，于各檢測孔加入100 μL樣本溶液，加入50 μL標準品和對照，孵育2 h，洗滌，加入200 μL偶聯抗體，孵育2 h，洗滌后加入200 μL底物，避光孵育30 min，加入20 μL 終止液。采用酶標儀(美國Thermo公司)測定各孔吸光度(A)值。根據標準曲線計算所測標本中各檢測指標的水平。

1.5 免疫組織化學法檢測絨毛組織中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6表達水平 絨毛組織行常規免疫組織化學方法染色，切片置于顯微鏡下觀察。Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α、IL-6陽性染色為細胞內有棕黃色顆粒，觀察其分布及染色深淺。經病理圖像分析系統(德國LEICA公司)在高倍鏡(×400)下照相，應用Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析軟件對每張切片的陽性區域進行定量檢測，測定陽性反應產物的積分吸光度(IA)值，代表Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6表達水平，染色越深，陽性反應越強，IA值越大。

2 結 果

2.1 2組研究對象臨床特征 與對照組比較，藥流組患者年齡、孕齡、孕次和產次比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 對照組和藥流組研究對象臨床特征

GroupnAge(year)Gestational age(t/d)GravidityParityControl5127.9±5.287.7±10.81.3±0.20.15±0.13Drug abortion 6828.1±3.788.4±11.31.4±0.30.13±0.08

2.2 2組研究對象血清中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6水平 與引產前比較，藥流組患者引產后血清中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6水平明顯升高(P<0.05)。與對照組引產前比較，藥流組患者引產前血清Ang-1、Ang-2、VEGF和TNF-α水平差異無統計學意義(P>0.05) ，IL-6水平明顯降低(P<0.05)；與對照組引產后比較，藥流組患者引產后血清中Ang-1、Ang-2、VEGF和TNF-α水平明顯升高(P<0.05)。對照組研究對象引產前后血清中Ang-1、Ang-2、VEGF、 TNF-α和IL-6水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組研究對象引產前后血清中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6 水平

Tab.2 Levels of Ang-1，Ang-2，VEGF, TNF-α,and IL-6 in serum of subjects in two groups before and after abortion

GroupnAng-1BeforeAfterAng-2BeforeAfterVEGFBeforeAfterControl5132.36±9.7031.75±7.6026.66±5.1027.47±5.9032.58±7.5030.75±5.60Drug abortion6830.18±3.8051.65±4.60?△27.65±4.1037.32±5.70?△31.81±5.1044.64±6.70?△GroupnTNF-αBeforeAfterIL-6BeforeAfterControl513.28±0.673.17±0.82 6.48±1.68 6.65±1.24 Drug abortion682.59±0.905.84±0.81?△3.17±1.04△5.67±0.51?

*P<0.05 compared with before abortion;△P<0.05 compared with control group.

2.3 2組研究對象絨毛組織中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6表達水平 與對照組比較，藥流組患者絨毛膜組織中Ang-1、Ang-2、VEGF和TNF-α 表達水平均明顯升高(P<0.05)，IL-6表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖1(插頁三)和表3。

2.4 相關性分析 Pearson分析結果顯示：藥流組患者血清中Ang-1水平與VEGF水平呈正相關關系(r=0.849,P=0.012)，Ang-2水平與VEGF水平呈正相關關系(r=0.721,P=0.026)；藥流組患者絨毛組織中Ang-1表達水平與VEGF表達水平呈正相關關系(r=0.590,P=0.019)，Ang-2表達水平與VEGF表達水平呈正相關關系(r=0.532,P=0.034)。見表4。

表3 2組研究對象絨毛組織中Ang-1、Ang-2 、VEGF、 TNF-α和IL-6表達水平

GroupnAng-1Ang-2VEGFTNF-αIL-6Control 514.25±0.612.65±0.105.61±1.612.88±0.778.84±1.95 Drug abortion6810.59±2.99?6.60±1.17?11.63±2.07?5.35±2.51?3.57±0.82?

*P<0.05 compared with control group.

表4 藥流組患者血清和絨毛組織中Ang-1和Ang-2水平與VEGF水平的相關性

Tab.4 Correlation between levels of Ang-1, Ang-2 and VEGF in serum and villus tissue of patients in drug abortion group

IndexVEGF in serumrPVEGF in villus tissuerPAng-10.8490.0120.5900.019Ang-20.7210.0260.5320.034

3 討 論

胚胎在妊娠過程中的生長發育需要豐富的血液供應所需養分[7]。絨毛膜的絨毛血管生成受到抑制將會導致稽留流產的發生[8-9]。Ang-1、Ang-2和VEGF參與血管形成和發育，在調節血管生成過程中發揮重要作用。VEGF能促進血管內皮細胞分裂，促進新生血管的生成，并維持血管壁的完整性和通透性，在維持血管功能方面具有重要作用[10]。VEGF表達水平的變化影響胎盤血管形成和胚胎生長發育。Ang包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4，共同調節血管生成及其穩定性[11]。其中Ang-1和Ang-2在懷孕期間的胎盤組織中呈高表達，參與胚胎發育、胎盤血管重建和子宮內膜周期性變化等，對女性孕期正常生殖功能的維持起重要作用[12-14]。正常情況下VEGF和Ang處于平衡狀態，VEGF刺激血管內皮細胞增殖，促進血管生成，在血管生成后期，Ang增強新生血管穩定性。此外，在VEGF作用下，Ang-2可拮抗Ang-1促血管結構穩定，消除血管基底膜和管周細胞對血管形成限制，增加內皮細胞對VEGF的敏感性，更有利于血管的出芽和生長[13]。VEGF、Ang-1和Ang-2水平變化會導致血管過度生成或抑制血管系統使血管退化，導致血管新生發生障礙，使胚胎著床失敗或妊娠并發癥的發生[14]。

TNF-α和IL-6是機體免疫調節的細胞活性因子，TNF-α屬于Th1型細胞因子，主要由巨噬細胞產生；IL-6屬于Th2型細胞因子，孕期子宮內 IL-6主要來源于子宮內膜上皮細胞，能夠通過減少機體免疫反應抑制母體排斥，更利于母體維持妊娠[15]。母體正常妊娠機體中Th2型細胞因子水平占優勢，稽留流產的發生與Th1/Th2失衡有一定聯系[16-18]。本研究結果顯示：藥流組患者給藥后，血清中TNF-α水平明顯高于給藥前，且絨毛組織中TNF-α表達水平明顯高于對照組，與文獻[19]結果一致。本文作者認為：米非司酮能促進免疫細胞分泌TNF-α等炎性因子，誘導流產發生，終止稽留流產；藥流組患者給藥前血清IL-6水平明顯低于對照組，可能是由于IL-6水平降低，抑制胚胎絨毛組織血管生成，導致缺氧損傷滋養層細胞和胎兒發育，是引發稽留流產原因之一；藥流組患者引產前絨毛組織中Ang-1、Ang-2和VEGF表達水平較對照組明顯降低，引產后明顯升高，絨毛組織中Ang-1、Ang-2和VEGF表達水平明顯高于對照組，患者絨毛組織中Ang-1、Ang-2表達水平和VEGF表達水平呈正相關關系，初步認為VEGF表達水平下降可抑制絨毛組織血管形成，導致供氧不足，Ang-1、Ang-2表達水平降低，最終導致滋養層細胞生長異常，導致稽留流產發生。稽留流產患者服用米非司酮后，Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6水平升高，緩解缺氧，促進絨毛滋養細胞增生，從而達到終止稽留流產的目的[20-21]。

本研究只選用了Th1細胞分泌的TNF-α因子與Th2細胞分泌的IL-6因子作為指標，由于機體免疫過程由多細胞因子參與，因此單一的指標不能準確反映出稽留流產患者治療過程中總體免疫水平變化，在后續的研究中應增加免疫細胞因子指標，深入探討Th1/Th2細胞因子與稽留流產的相關性。