菩人丹超微粉對STZ誘導糖尿病大鼠視網膜病變的保護作用及其對NF-κB信號通路的影響

王海彬，董志軍，郭立濤，石 晶，董微麗

(承德醫學院附屬醫院眼科，河北 承德 067000)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病引致視網膜微血管病變和神經組織病變的常見并發癥，是導致視力損害的重要原因，近年來DR的發病率呈上升趨勢，嚴重影響患者的生活質量[1]。研究[2-3]表明：血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素2(angiopoietin-2，Ang-2)作為防治DR的重要標志，可反映視網膜組織的損傷程度。另有研究[4-5]表明：晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)/晚期糖基化終末產物受體(receptor of advanced glycation end products，RAGE)/核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路在DR過程中起重要作用。

菩人丹超微粉(Purendan Superfine Powder,簡稱PRD)是以苦瓜為君藥，以人參和丹參為臣藥，加以制首烏、水蛭和葛根配伍組成的中藥復方，具有益氣養陰清熱、活血化瘀通絡之功效。研究[6]表明：PRD對病機為“熱、虛、瘀”的糖尿病患者有明顯療效。但目前尚無有關PRD對DR影響的相關機制的研究。為進一步探討PRD對DR的保護作用，本研究主要觀察PRD對糖尿病模型大鼠視網膜組織中VEGF和Ang-2蛋白表達的影響，并從AGEs/RAGE/NF-κB信號通路探討PRD對糖尿病大鼠視網膜微血管損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑和儀器 PRD(河北以嶺藥業集團有限公司)，鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，VEGF和Ang-2引物序列(上海生工生物工程有限公司)，兔抗VEGF 抗體(美國Cell Signalling公司)，Ang-2、AGEs和RAGE抗體(英國Abcam公司)，NF-κB P65(美國CST公司)，抗兔辣根過氧化物酶(HRP，上海長島生物技術有限公司)。OneTouch?UltraVue血糖儀(上海強生醫療器材有限公司)，電泳儀(西安東澳生物科技有限公司)，圖像分析軟件Quantity One 4.3.1(美國Bio-rad公司)。

1.2 實驗動物、分組和給藥 雄性Wistar大鼠40只，SPF級，體質量200～250 g，購自河北省實驗動物中心，動物許可證號: SCXK(冀) 2016-0002。適應性喂養1周，實驗室溫度22℃～28℃，相對濕度60%～78%。40只大鼠隨機分為正常對照組、模型組、低劑量PRD組和高劑量PRD組，每組10只。模型組、低劑量PRD組和高劑量PRD組大鼠禁食12 h后，腹腔注射2% STZ(60 mg·kg-1)，每天1次，制備糖尿病動物模型。連續注射3 d后空腹后取鼠尾血，采用血糖儀測定血糖，以血糖水平≥16.7 mmol·L-1為糖尿病大鼠模型建立成功的標準[7-8]。待模型成功建立后，低劑量和高劑量PRD組大鼠分別灌胃給予1.2和2.4 g·kg-1PRD ，大鼠給藥劑量根據成人給藥劑量按體表面積換算，大鼠每日等效劑量(g·kg-1)=6.3×成人每日劑量(g·kg-1)，自造模成功起連續給藥3個月。正常對照組、模型組大鼠分別灌胃給予等體積生理鹽水。實驗期間大鼠自由進水和進食，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.3 標本收集 大鼠禁食12 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉，打開腹腔，腹主動脈置管，取血測定血糖，用生理鹽水灌洗至眼球蒼白，迅速摘除雙眼眼球，去除眼前節及玻璃體，于顯微鏡下鈍性分離視網膜組織，置于-80℃下儲存，用于實時定量逆轉錄-多聚酶鏈反應(RT-PCR)和Western blotting法檢測。

1.4 RT-PCR法檢測大鼠視網膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA表達水平 提取視網膜組織總RNA，按照Thermo公司逆轉錄試劑盒的方法轉錄成cDNA，以此為模板進行半定量PCR檢測，以β-actin基因的表達作為內參照。目的基因VEGF和Ang-2引物序列見表1。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環35次；72℃延伸10 min。PCR結束后以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增目的基因cDNA片段的質量，凝膠成像系統分析，以PCR產物的DNA擴增條帶的灰度值和內參物擴增條帶灰度值的比值作為VEGF和Ang-2 mRNA表達水平。

表1 VEGF和Ang-2引物序列

1.5 Western blotting法檢測視網膜組織中AGEs、RAGE、NF-кB、VEGF和Ang-2蛋白表達水平 取液氮中保存的視網膜組織，加入PBS(0.01 mmol·L-1，pH7.4)1 mL于勻漿器中冰浴下勻漿， 4℃、6 000 r·min-1離心30 min，棄上清，向沉淀物中加入200 μL全細胞裂解液冰浴裂解 40 min，4℃、12 000 r·min-1高速離心15 min，收集上清液，按照試劑盒方法對蛋白濃度進行定量，蛋白上樣量為50 μg，12% SDS-PAGE凝膠電泳，80～120 V、2 h，電泳完畢后轉移至PVDF膜(孔徑0.45 μm，美國Pall公司)上；5%脫脂奶粉TBST封閉2 h；加入AGEs(1∶1 000)、RAGE(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、VEGF(1∶200)和Ang-2(1∶200)抗體，PVDF膜用0.5% TBS-T溶液洗膜3次，每次5 min，用二抗辣根過氧化物酶(HRP,1∶5 000)交聯物室溫搖床孵育1 h，0.5% TBS-T溶液洗膜3次后，顯影，對顯影條帶進行灰度分析，以GAPDH作為內參，計算AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2條帶與GAPDH條帶的灰度值比值，代表目的蛋白的表達水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠血糖水平 各組大鼠注射STZ造模24 h后出現多食、多飲和多尿表現，48 h后出現體質量下降和行動遲緩。與正常對照組比較，模型組大鼠體質量明顯降低(P<0.05)，血糖水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，低和高劑量PRD組大鼠體質量明顯升高(P<0.05)，血糖水平明顯降低(P<0.05)；與治療前比較，治療后低和高劑量PRD組大鼠血糖水平明顯降低(P<0.05)，高劑量PRD組較低劑量PRD組降糖效果更佳。見表2。

表2 各組大鼠體質量和血糖水平

GroupBody weight(m/mg)Before treatmentAfter treatmentBlood glucose[cB/(mmol·L-1)]Before treatmentAfter treatmentNormal control224.05±11.55285.94±12.346.10±4.566.67±2.83Model201.41±9.36?206.31±24.61?21.74±1.93?23.74±5.30?PRD Low dose 204.31±8.04?253.83±11.29△20.88±2.37?15.03±2.73△# High dose 203.53±10.34?275.55±15.36△21.56±2.53?14.64±2.69△#

*P<0.05 compared with normal control group;△P<0.05 compared with model group;#P<0.05 compared with before treatment.

2.2 各組大鼠視網膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA表達水平 與正常對照組比較，模型組大鼠視網膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，低和高劑量PRD組大鼠視網膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，高劑量PRD組較低劑量組降低更明顯。見圖1和表3。

Lane 1: Normal control group;Lane 2: Model group;Lane 3:Low dose of PRD group； Lane 4:High dose of PRD group.

圖1 RT-PCR法檢測各組大鼠視網膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA表達電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of VEGF and Ang-2 mRNA in retinal tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

表3 各組大鼠視網膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA表達水平

GroupVEGF mRNAAng-2 mRNANormal control0.73±0.020.68±0.04Model1.18±0.03?1.14±0.07?PRD Low dose 1.08±0.01△0.95±0.05△ High dose 0.90±0.02△0.75±0.04△

*P<0.05 compared with normal control group;△P<0.05 compared with model group.

2.3 各組大鼠視網膜組織中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表達水平 與正常對照組比較，模型組大鼠視網膜組織中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量和高劑量PRD組大鼠視網膜AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，高劑量PRD組較低劑量PRD組降低更明顯。見圖2和表4。

Lane 1: Normal control group；Lane 2: Model group；Lane 3:Low dose of PRD group ；Lane 4:High dose of PRD group.

圖2 Western blotting法檢測各組大鼠視網膜組織中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表達電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of AGEs,RAGE,NF-κB,VEGF， and Ang-2 proteins in retina tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

表4 各組大鼠視網膜組織中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表達水平

GroupsAGEsRAGENF-кBVEGFAng-2Normal control0.29±0.020.33±0.010.45±0.040.48±0.030.42±0.03Model0.46±0.04?0.59±0.01?0.91±0.04?1.01±0.04?0.95±0.04?PRD Low dose 0.38±0.02△0.43±0.04△0.74±0.03△0.70±0.01△0.76±0.02△ High dose 0.33±0.01△0.36±0.01△0.64±0.01△0.58±0.02△0.63±0.02△

*P<0.05 compared with normal control group;△P<0.05 compared with model group.

3 討 論

糖尿病歸屬為中醫“消渴”，病機特點為“陰虛為本，燥熱為標；氣陰兩傷，陰陽俱虛；變證百出，常夾血瘀”，其中“熱”“虛”“瘀”為發病的關鍵[9-10]。中藥治療主要遵循“清熱”“補虛”“祛瘀”療法。PRD由苦瓜、人參、丹參、首烏、水蛭和葛根配伍組成，方中人參、首烏補氣養血，丹參、水蛭活血化瘀，苦瓜、葛根清熱涼血兼明目，各中藥配伍使用，達到清熱和營、祛瘀通絡的目的。

DR損傷的特征包括內皮細胞功能障礙、血視網膜屏障、視網膜血流量變化、局部缺血和新血管化[11-12]。研究[13]顯示：DR的損傷程度與VEGF和Ang-2有密切關聯。VEGF是一種血管生成因子和促炎癥因子，對視網膜組織血管生成和水腫的發生有明顯影響[14]。Ang-2作為一種促血管生成素，與VEGF具有協同作用，可增加視網膜血管通透性，導致視網膜血管內皮細胞功能障礙和慢性炎癥的發生[15-16]。本研究結果顯示：模型組大鼠視網膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA及蛋白表達水平均明顯升高，說明模型建立成功；用藥后PRD組大鼠血糖水平明顯降低，同時VEGF和Ang-2 mRNA及蛋白表達水平降低，且高劑量PRD組大鼠降低更明顯，表明PRD對大鼠DR具有顯著療效。

DR過程中，視網膜組織可產生AGEs，AGEs通過增加血管內皮通透性，促進細胞因子釋放和活化蛋白激酶，引起炎癥反應，導致視網膜組織病變[17]。NF-κB是一種廣泛存在于體內多種細胞的核轉錄因子，調節多種細胞因子的合成與釋放，在機體的免疫和炎癥反應、凋亡調控等方面發揮重要作用[18]。AGEs特異性受體RAGE屬于免疫球蛋白超家族的細胞表面分子，可結合并降解AGEs。研究[19]證明：發生糖尿病和氧化應激時，RAGE 表達可明顯升高。AGEs通過與RAGE結合激活NF-κB，同時NF-κB作為RAGE的啟動子促進AGEs與RAGE進一步結合，產生正反饋作用[20]。本研究結果顯示：PRD可明顯降低糖尿病大鼠視網膜組織中AGEs、RAGE和NF-κB蛋白表達水平，表明PRD可降低AGEs的產生，抑制AGEs與RAGE結合，減少NF-κB的分泌，特異性阻斷AGEs/RAGE/NF-κB信號通路。

綜上所述，PRD對糖尿病大鼠視網膜具有保護作用，下調糖尿病大鼠視網膜組織中VEGF和Ang-2 mRNA及蛋白表達水平，特異性阻斷AGEs/RAGE/NF-κB信號通路，減少視網膜微血管滲漏及病理性新生血管生成，減少AGEs形成，減輕炎癥反應，是其發揮保護作用的機制之一。