林蛙油鑒別的研究進展

金 平，張 宇，王 會，蘭 夢，張 輝，孫佳明

（長春中醫(yī)藥大學，長春 130117）

哈蟆油（Oviduetus Ranae）俗稱田雞油、哈螞油、哈士蟆油，系蛙科動物中國林蛙（Rana temporaria chensinesis David）雌蛙的輸卵管經(jīng)干燥而得[1]。哈蟆油始載于《本草綱目》，具有補腎益精、養(yǎng)陰潤肺等功能，主要用于身體虛弱、病后失調(diào)、精神不足、癆嗽咳血等癥。哈蟆油作為傳統(tǒng)而名貴的中藥材，因其價格高昂，市場上同屬和混偽品較多，藥材的真?zhèn)舞b別更加的重要[2]。除傳統(tǒng)的四大鑒定方法外，現(xiàn)在還有高效毛細管電泳、紅外指紋圖譜、HPLC指紋圖譜、分子生物學等鑒別方法。

1 傳統(tǒng)的鑒別方法

1.1 基源鑒別 中國林蛙外形似青蛙，體長約為7～9 cm。頭部長與寬相等，吻端位置略突出于下頜。眼間距等于上眼瞼寬度小于鼻間距，前肢短而后肢長且長度超過體長的一半，疣粒存在與脛跗關(guān)節(jié)前達眼，兩側(cè)褶間以及肩部并以 V形排列，膚色在季節(jié)不同時存在不同，秋冬較夏季略深，顏色分別為褐色和黃褐色，腹面為紅黃色，有灰白色斑點塊[3]。

1.2 性狀鑒別 輸卵管為黃白色并帶有脂肪樣光澤，可見毛細血管，長度為體長的4～8倍，重量為體質(zhì)量的20%～26%，大小不一重疊成塊狀或片狀。有些帶有灰白色薄膜狀干皮和黑色卵塊，質(zhì)地硬而脆。鑒別時以顏色偏白，個大肥厚有光澤，并且不存在黑色卵塊和干皮為優(yōu)[4]。

1.3 顯微鑒別 滕淼娟[5]對哈蟆油及一種偽品癩哈蟆油進行顯微鑒定。顯微鏡下通過對腺體細胞形狀、排列、細胞壁及腺體紋理的區(qū)別，來鑒別哈蟆油的真?zhèn)巍?/p>

1.4 理化鑒別

1.4.1 膨脹度 滕淼娟[5]運用溫水試驗哈蟆油迅速膨脹且體積增大至15倍且為白色棉絮狀，而癩哈蟆油吸水少、膨脹慢不呈棉絮狀，體積增大近7倍。而膨脹度測定按藥典標準規(guī)定，不得低于55，真品為58符合規(guī)定，而偽品僅為21.8。

1.4.2 熒光鑒別 張琴等[6]根據(jù)真?zhèn)纹吩?65 nm波長的熒光燈下顯色不同進行鑒別，即正品為黃色熒光，偽品為亮藍色熒光。

1.4.3 薄層色譜鑒別 徐陽[7]較原有的哈蟆油薄層鑒別方法，增加了膽固醇、7-羥基膽固醇、7-酮基膽固醇和 LD-2作為對照物質(zhì)，在254 nm紫外燈光下，噴以10%硫酸乙醇溶液檢視，此方法具有快速、準確、成本低廉等優(yōu)勢，可作為哈蟆油鑒別的參考方法。

2 儀器分析的鑒別方法

2.1 凝膠電泳法 富玉海等[8]運用凝膠電泳法鑒別正偽品哈士蟆油，正品有明顯6個條帶，偽品由于不純而條帶數(shù)量不明確。鮑悅等[9]分別取舒蘭、樺甸、內(nèi)蒙古、青海4個地區(qū)的哈蟆油作為正品哈蟆油，并將大蟾蜍輸卵管作為偽品，將其進行 SDS- PAGE電泳的凝膠成像分析，結(jié)果得出4個不同區(qū)域的哈蟆油均有明顯的6條主帶，而偽品明顯的譜帶只有一條帶。

2.2 HPLC指紋圖譜法 白雪媛等[10]用95%乙醇作為哈蟆油提取溶劑，以乙腈- 0.5%磷酸溶液為流動相進行檢測，運用色譜聚類分析得出不同品種之間存在顯著差別。黃玉明等[11]對15批正品林蛙油其偽劣品進行 HPLC圖譜分析比對，結(jié)論以相似度為0.85作為合格標準。李津明等[12]運用HPLC測定10批林蛙油樣品的丙酮提取物，結(jié)果得出17個相應(yīng)位置的共有峰作為鑒定林蛙油的指標峰。

2.3 紅外光譜法 王永生等[13]分析不同產(chǎn)地來源的哈蟆油使用不同的紅外光譜儀對同一藥材進行了對比試驗。根據(jù)不同產(chǎn)地的正品哈蟆油主成分種類相似在譜圖中的存在相關(guān)系數(shù)建立了正品哈蟆油紅外特征光譜，可作為哈蟆油的質(zhì)量控制的依據(jù)。

2.4 紫外光譜法 王永生等[14]將收集到的7個不同的偽品和5種正品哈蟆油的有機溶劑超聲提取液分別進行了紫外光譜法鑒別對比分析，且真?zhèn)纹吩诜逍巍⑽辗鍞?shù)量和峰位均有明顯差別。

2.5 原子吸收光譜法和發(fā)射光譜法 王秋雨等[15]用原子分光光度計入和等離子發(fā)射光譜儀測定哈蟆油與青蛙油中微量元素和重金屬的含量，結(jié)果顯示兩者均含有人體所必需的常用微量元素，但青蛙油中重金屬含量超出標準范圍。李媛媛等[16]采用等離子體發(fā)射光譜法對國產(chǎn)和俄羅斯產(chǎn)哈蟆油進行無機元素含量分析。

3 分子生物學

3.1 RAPD法鑒別 張晗思等[17]對哈蟆油及其4種常見混偽品堿裂解法提取基因組 DNA，2步循環(huán)PCR程序進行PCR反應(yīng)，該方法在加入2 μL 100×SYBR Green I染料，正品顯明亮綠色熒光，而混淆品不顯示熒光。此方法準確、簡便、快捷。

3.2 COI條形碼DNA分子鑒定 王孟虎等[18]建立了東北、中國、恒仁、黑龍江林蛙的COI基因數(shù)據(jù)庫，能有效區(qū)分不同地域林蛙，說明DNA分子鑒定技術(shù)是鑒定哈蟆油基原動物的新的方法。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，本文從傳統(tǒng)的鑒別、儀器分析鑒別和分子生物學鑒別3個方面闡述了林蛙油鑒別方法的研究進展。可以看出中藥材質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別的技術(shù)方法越來越先進和完善。不同學科的相互補充和結(jié)合，加速中藥鑒別的發(fā)展。傳統(tǒng)的方法固然經(jīng)典，但是新的技術(shù)更加的準確與快速。我們應(yīng)該進一步探索和發(fā)現(xiàn)中藥鑒別特征性甚至是專屬性的物質(zhì)，為中藥的鑒定提供更好的方法。