蒲公英炮制前后總黃酮含量差異研究

巨紅葉，葛心怡，焦 瑩，趙 波，劉長樂，宋 逍

（陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046）

蒲公英為菊科植物蒲公英Taraxacum mongoLicum Hand.- Mazz、堿地蒲公英Taraxacum boreaLisinense Kitag.或同屬數種植物的干燥全草，藥性為苦、甘、寒，歸肝、胃經。含有多糖類、萜類、有機酸類、總黃酮類等成分，其中總黃酮類為主要有效成分。有清熱解毒、消腫散結、利濕通淋的功效[1-4]。蒲公英現在臨床上主要用于治療胃潰瘍、胃炎等疾病[5-7]。

陜西中醫藥大學附屬醫院全國名中醫的臨床經驗方胃舒優在臨床上治療胃炎、胃潰瘍等胃病效果極佳，而處方中的君藥用的是蒲公英的炮制品—蒲公英炭。藥物炒炭后可增強藥物止血止瀉的功效或使其產生止血止瀉的功效，還可緩和藥性，降低毒性[8]。現代藥理學認為，炭藥具有吸附毒素、改善胃腸功能、抗炎等作用。2015版中國藥典第四部通則0213炒炭質量標準為“取待炮炙品置熱鍋內用武火炒至表面焦黑色、內部焦褐色或至規定程度時，噴淋清水少許，熄滅火星，取出，瞭干”[9]。《金匱要略方論》中記載炒炭的質量標準為“燒炭存性，勿令灰過”“炒令黑勿太過”[10]，炒炭工藝雖簡單，但實際上不好控制程度。并且，臨床治療胃炎、胃潰瘍多用蒲公英原藥材。基于此，本課題以蒲公英中主要有效成分總黃酮為研究對象，采用超聲提取法[11-18]研究蒲公英炮制前后總黃酮含量差異。

1 實驗材料

QE-300 g型高速萬能粉碎機（浙江屹立工貿有限公司），BL-T650CT多用途恒溫超聲波提取機（西安比朗生物科技有限公司），DC-0506低溫恒溫槽（西安比朗生物科技有限公司），UV-2600（SHIMADZU），N-1200B旋轉蒸發儀，ZKF040型真空干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）。蒲公英藥材購自于西安萬壽路藥材市場，經生藥教研室王繼濤老師鑒定為蒲公英屬Taraxacum F.H.Wigg植物蒲公英，蘆丁標品（中國食品藥品檢驗所，批號：100080-201610），無水乙醇（天津市科密歐化學試劑有限公司）。

2 實驗方法

2.1 超聲提取條件設計 考慮乙醇濃度（A），超聲時間（B），超聲溫度（C），超聲功率4種因素（D），每個因素3水平，以總黃酮含量為考察指標，確定最佳提取工藝[19-24]。因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 蒲公英供試溶液的制備 將適量蒲公英全草粉碎成細粉和粗粉混用（細粉極易吸潮，不利于實驗的進行）干燥至恒重，稱取9份8.00 g分別按1.3正交試驗設計超聲提取，趁熱抽濾得濾液，旋蒸到30 mL倒在蒸發皿上，60 ℃水浴蒸干至膏體，60 ℃減壓干燥，碾成粉末備用。取適量粉末置于25 mL容量瓶中，用85%的甲醇定容并完全溶解。過0.45 μL的濾膜后精密量取2 mL藥液置于25 mL的容量瓶內，加5%硝酸鈉溶液1.0 mL，6 min后加10%硝酸鋁1.0 mL，6 min后加4% NaOH 10 mL，加水至刻度，搖勻后室溫放置15 min，待測（標號為蒲1～蒲9）。

2.2.2 蒲公英炭供試溶液的制備 1）蒲公英炭的制備 抓切制之后適量的蒲公英放于炒鍋內，用武火加熱，快速翻炒至略大于一半的蒲公英表面焦褐色，再迅速轉為文火，炒至全部蒲公英表面焦褐色，噴淋清水少許，熄滅火星，取出晾干（通則0213）。隨機挑選炒好后的蒲公英藥材，折斷藥材，沒有灰化，部分炭化，沒有炭化的部分還能看出蒲公英原有的形狀即可（蒲公英為全草類藥材，質地較輕，極易灰化，所以對于火候和炒制時間的把握極為重要。本實驗中先用武火將鍋燒熱，再將蒲公英藥材倒入鍋中，30 s后迅速轉為文火，防止蒲公英灰化）。2）蒲公英炭供試溶液的制備 將炒好的蒲公英炭粉碎成細粉和粗粉混用，干燥至恒重，稱取9份5.00 g分別按2.1正交試驗設計超聲提取，再按2.2.1操作進行即可（標號為蒲炭1～蒲炭9）。

2.3 總黃酮含量的測定

2.3.1 蘆丁對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重蘆丁對照品23.03 mg，置于50 mL容量瓶中，用85%的甲醇完全溶解并定容，蘆丁對照品濃度為，分別取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL置于25 mL（標號為標1～標7）的容量瓶中，按2.2.1中的顯色方法顯色，即得。

2.3.2 蘆丁吸收曲線 將已制備好的7個蘆丁對照品溶液置于紫外分光光度計中，在200～800 nm（間隔1 nm）下全波長掃描，以吸光度（A）為縱坐標，波長（λ）為橫坐標作圖，得到吸收曲線，最大吸收波長為508 nm。因此選定508 nm作為本實驗中對照品和樣品檢測波長。

2.4 線性關系考察 吸取蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，依 2.2.1項下方法在508 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）為橫坐標，濃度（C）為縱坐標，繪制標準曲線。結果顯示蘆丁濃度在0.017 2～0.062 7 mg/mL間具有良好的線性關系，回歸方程為C = 0.091A- 0.001，r = 0.997 8

表2 蘆丁對照品溶液濃度與吸光度（λ = 508 nm）的數據表

2.5 樣品中總黃酮的含量測定 分別將提取得到的供試品溶液（蒲1～蒲9及蒲炭1～蒲炭9），按照2.2.1項下的方法在508 nm處采用分光光度法進行測定，計算總黃酮含量，數據見表3與表4。因素水平見表1，L9（34）正交試驗設計與試驗結果見表3與表4，結合方差分析表5與表6，由結果可知影響因素主要為乙醇濃度與超聲功率，并且大小順序為乙醇濃度＞超聲功率。提取時間與提取溫度對總黃酮含量的影響并無顯著性差異。蒲公英最優提取工藝和蒲公英炭最優提取工藝為A1B3C3D3（提取溶劑為65%乙醇，超聲功率為462 W，超聲時間為35 min，超聲溫度為60 ℃）。數據見表7。

3 結果

最優提取方法下蒲公英與蒲公英炭總黃酮提取率的比較 根據表8分析數據得出以下結論：蒲公英在提取溶劑為65%乙醇，超聲功率為462 W，超聲時間為35 min，超聲溫度為60 ℃的超聲條件下提取率最高，此超聲條件（A1B3C3D3）為蒲公英最優超聲提取條件，提取率為3.9%；蒲公英炭在提取溶劑為65%乙醇，超聲功率為462 W，超聲時間為35 min，超聲溫度為60 ℃的超聲條件下提取率最高，此超聲條件（A1B3C3D3）為蒲公英炭最優超聲提取條件，提取率為2.9%。

表3 蒲公英總黃酮超聲提取正交試驗設計

表4 蒲公英炭總黃酮超聲提取正交試驗設計

表5 蒲公英總黃酮超聲提取正交試驗設計方差分析表

4 方法學考察

4.1 穩定性試驗 取蒲3供試品溶液和蒲炭3供試品溶液按顯色后每10 min在508 nm處用紫外分光光度計依法測定吸光度值，測定7次。計算RSD值分別為0.42%和0.60%，說明蒲3供試品溶液和蒲炭3供試品溶液在70 min內穩定。

表6 蒲公英炭總黃酮超聲提取正交試驗設計方差分析表

表7 蒲3及蒲炭3供試溶液濃度與吸光度（508 nm）的數據表

表8 供試品溶液（蒲3、蒲炭3）數據處理表

4.2 精密度試驗 精密吸取制備的總黃酮對照品1.0 mL 5份（標號為1～5），按標準曲線制備方法測定吸光度（A），計算RSD值為1.04%。

4.3 重復性試驗 精密吸取的蒲公英供試品液（蒲3、蒲炭3）1.0 mL 5份，按標準曲線制備方法測定吸光度（A），計算RSD值分別為0.85%和0.70%。表明重現性良好。

5 討論

在最優超聲提取條件下，蒲公英總黃酮的提取率是蒲公英炭總黃酮提取率的1.34倍，原因可能為蒲公英在炒炭過程中部分炭化導致總黃酮有效成分部分被破壞。

而且經研究炒炭工藝的質量標準難以控制，就蒲公英總黃酮這一有效成分的含量而言，用蒲公英提取比蒲公英炭提取的效果好，這為在臨床上治療胃炎、胃潰瘍使用蒲公英原藥材提供了科學依據。