回醫(yī)烙灸療法對(duì)脊髓損傷大鼠Notch信號(hào)通路中Presenilin1、Hes1蛋白表達(dá)的影響

夏 鉑，范 靈

(寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004）

脊髓損傷是一種臨床上比較嚴(yán)重的損傷性疾病，目前并沒(méi)有特別有效的治療手段，僅停留在對(duì)癥治療。回醫(yī)烙灸療法是一種治療脊髓損傷的新方法，在臨床上已經(jīng)取得一定療效。本實(shí)驗(yàn)取損傷脊髓組織，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)大鼠脊髓組織中Notch信號(hào)通路中Presenilin1、Hes1蛋白表達(dá)，旨在從分子生物學(xué)角度探討回醫(yī)烙灸療法對(duì)不同介入時(shí)間大鼠脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)功能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成，選取清潔級(jí)SD大鼠75只（寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，12周齡，體質(zhì)量230～305 g，雄性）。

1.2 方法

1.2.1 分組 選取清潔級(jí)SD大鼠75只，隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：A 組（假手術(shù)組）、 B 組（模型組）、C 組（西藥組）、D組（2 h烙灸組）、E組（6 h烙灸組），于第1、7、14、28 d每組各取3只損傷脊髓組織，共取60只，15只備用，免疫組化法檢測(cè)大鼠脊髓組織中Presenilin1、Hes1蛋白表達(dá)。A 組（假手術(shù)組），只做椎板切除，不做脊髓損傷；B 組（模型組），脊髓Allen’s打擊損傷后灌胃給予一定量生理鹽水，持續(xù)28 d；C 組（西藥組），脊髓Allen’s打擊損傷后0.5 h內(nèi)首次按20 mg/kg醋酸潑尼松，隨后按 4.6 mg/（kg·h）給藥，3 h連續(xù)給藥，之后按7.2 mg/（kg·d），連續(xù)給藥7 d；D組（2 h烙灸組），脊髓Allen’s打擊損傷后2 h采用烙灸治療，烙灸隔日1次，1次5 min，持續(xù)28 d；E組（6 h烙灸組），脊髓Allen’s打擊損傷后6 h采用烙灸治療，烙灸隔日1次，持續(xù)28 d。各組于術(shù)后1 h經(jīng)皮下注射4萬(wàn)u/kg慶大霉素，1次/d，連續(xù)7 d。各組均給予一定量生理鹽水，持續(xù)28 d。

1.2.2 模型制備 改良的脊髓損傷Allen’s[1]造模。操作：大鼠麻醉、消毒，以T10為中心，沿脊柱方向切約3 cm的切口，切開(kāi)皮膚、肌肉，分離并暴露棘突，將T10椎板全部切除，保留硬脊膜。采用自制的 Allen’s 改良式打擊裝置（將 15 g打擊棒套入鋼管內(nèi)，卡住打擊高度，松開(kāi)打擊棒即可下落） ，高度為5 cm，致傷量為75 g/cm，造成 T10～ T11節(jié)段急性脊髓損傷（此致傷量可造成大鼠的不完全性截癱，屬中等程度損傷）。動(dòng)物出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀體回縮撲動(dòng)后，見(jiàn)雙下肢不完全癱瘓，標(biāo)志造模成功。

1.2.3 治療方法 固定大鼠，回醫(yī)特制烙灸器放在損傷大鼠兩側(cè)夾脊穴（在距損傷上下端兩個(gè)椎體的棘突間隙旁開(kāi)距中線(xiàn)3～4 mm處取穴)。回醫(yī)特制烙灸器利用自制和脊柱形狀相似鐵質(zhì)灸具制成，在灸槽內(nèi)放有艾絨，點(diǎn)燃艾絨，利用鐵質(zhì)灸具熱傳導(dǎo)，使局部發(fā)紅，排出異常體液。部位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》（上海科學(xué)技術(shù)出版社）烙灸組于造模后2、6 h分別開(kāi)始，隔日同一時(shí)間重復(fù)治療1次，每次灸5 min，持續(xù)28 d，并防止時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成皮膚損傷。

1.2.4 標(biāo)本采集 每組又按不同時(shí)間點(diǎn)分別在1、7、14、28 d各取3只，共取60只，15只備用，處死大鼠，取脊髓損傷部位上下1 cm的脊髓組織，制成免疫組化染色切片，進(jìn)行免疫組化染色。

1.2.5 免疫組化染色 常規(guī)石蠟切片，脫蠟和水化，PBS洗5 min，滴加3%甲醇-H2O2溶液，濕盒室溫靜置15 min。PBS洗3次各5 min，抗原修復(fù)，微波爐中高火力4 min，低火20 min，自然降至室溫。PBS洗3次各5 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫30～60 min，甩去多余液體，滴加I抗100 μL，4 ℃過(guò)夜，37 ℃復(fù)溫45 min。PBS洗3次各10 min，滴加Ⅱ抗100 μL，室溫靜置1 h。PBS洗3次各10 min，DAB顯色3 min，在顯微鏡下掌握染色程度。PBS洗 3次各5 min，蘇木精復(fù)染5 min，自來(lái)水洗15 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.3 圖像采集與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 每組選取6張圖像（400倍），釆用Image-Pro Plus Analysis Soft ware 6.0進(jìn)行圖像分析，選取有效區(qū)域進(jìn)行累積光密度值統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）表示。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)正態(tài)且方差齊時(shí)，釆用單因素方差分析LSD法進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)非正態(tài)和（或）方差不齊時(shí)，進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Presenilin1免疫組化染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果 染色圖像Presenilin1免疫陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)呈現(xiàn)深褐色，主要出現(xiàn)在大鼠脊髓組織中的前角、中央管附近、后角部位。A組大鼠脊髓組織中有極少量陽(yáng)性細(xì)胞顯色。B、C、D、E組可見(jiàn)不同程度的顏色改變，B組顯色最為明顯，D、E組顯色較輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組在術(shù)后14 d，免疫組化染色（200×）

統(tǒng)計(jì)結(jié)果：通過(guò)圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化圖像光密度的測(cè)算，第1、7、14、28 d，B、C、D、E組均大于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。損傷7、14 d，C、D、E組均小于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），C、D、E組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；損傷28 d，D、E組小于B、C組，且D組表達(dá)率最顯著減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。2.2 各組大鼠Hes1免疫組化染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果 染色圖像Hes1免疫陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)呈現(xiàn)棕黃色或棕灰色，主要出現(xiàn)在大鼠脊髓組織中的前角、中央管附近、后角部位。A組大鼠脊髓組織中有弱陽(yáng)性表達(dá)。B組大鼠脊髓組織中受損局部Hes1呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而且較A組顯著增強(qiáng)。B、C、D、E組可見(jiàn)黃色、深褐色不同程度的顯色，B組顯色最為明顯，D、E組顯色較輕。見(jiàn)圖2。

表1 各組大鼠Presenilin1蛋白表達(dá)的平均光密度比較（x± s ，n = 12）

圖2 各組在術(shù)后14 d，免疫組化染色（200×）

統(tǒng)計(jì)結(jié)果：通過(guò)圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化圖像光密度的測(cè)算，第1、7、14、28 d，B、C、D、E組均大于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。損傷7、14 d，C、D、E組均小于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），C、D、E組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）；損傷28 d，D、E組小于B、C組，且D組表達(dá)率最顯著減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠Hes1蛋白表達(dá)的平均光密度比較（x± s ，n = 12）

3 討論

3.1 關(guān)于脊髓損傷大鼠Notch信號(hào)通路研究進(jìn)展 脊髓損傷是由交通傷、墜落傷、跌倒傷、暴力或運(yùn)動(dòng)等因素引起的一種高致殘性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，不僅會(huì)導(dǎo)致受損節(jié)段以下的感覺(jué)功能、運(yùn)動(dòng)功能、以及自主神經(jīng)功能的障礙，而且會(huì)引起其他系統(tǒng)的功能障礙，進(jìn)而影響到患者心理健康及正常社會(huì)交往[2-3]。它是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，能造成患者嚴(yán)重的神經(jīng)功能損害，目前臨床上仍缺乏有效的方法來(lái)修復(fù)脊髓損傷[4-5]。脊髓損傷屬中醫(yī)瘀血所致“痿證”范疇，其致殘率和病死率極高[6]。全球每年有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的人遭受脊髓損傷的折磨，對(duì)病人產(chǎn)生毀滅性的打擊，有效的治療對(duì)于脊髓損傷患者來(lái)說(shuō)不僅可以極大地提高生活質(zhì)量，還可以減輕他們的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7]。其中交通事故為脊髓損傷的首要原因，占 46. 9%。其次是工傷事故，占 33. 1%，其他損傷包括運(yùn)動(dòng)失誤、生活中的損傷、火器傷及銳器傷等[8-9]。 目前，醫(yī)學(xué)界雖然對(duì)脊髓損傷的發(fā)生機(jī)制還不十分清楚，但研究顯示，脊髓損傷的發(fā)生是一種多因素、多步驟的級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)機(jī)制[10-11]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，繼發(fā)性損傷是導(dǎo)致急性脊髓損傷肢體功能障礙的主要原因之一[12]。由于中樞神經(jīng)結(jié)構(gòu)的特殊性，使脊髓損傷修復(fù)的研究經(jīng)歷了漫長(zhǎng)而曲折的過(guò)程，讓損傷的脊髓再生，因此成為許多神經(jīng)科學(xué)家夢(mèng)寐以求的目標(biāo)[13]。 Notch信號(hào)通路是一條與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡密切相關(guān)的信號(hào)通路，在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程中也有著至關(guān)重要的作用[14]。Ben-Shushan[15]等研究發(fā)現(xiàn)，抑制 Notch信號(hào)通路可以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化。在對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的研究中還發(fā)現(xiàn)，低水平的Notch信號(hào)還可以促進(jìn)神經(jīng)突的生長(zhǎng)延伸，而上調(diào)Notch信號(hào)后則抑制神經(jīng)突的延伸甚至導(dǎo)致神經(jīng)突的回縮。Notch受體在S3切割位點(diǎn)水解的關(guān)鍵是γ-Secretase，是Notch信號(hào)通路的核心環(huán)節(jié)，而Presenilin1是γ-Secretase的活性中心，Presenilin1與其他幾種蛋白質(zhì)結(jié)合成一個(gè)蛋白剪接復(fù)合體，負(fù)責(zé)Notch受體在S3切割位點(diǎn)的剪接[16]。Hes1是Notch信號(hào)通路的重要基因，Hes1高表達(dá)時(shí)可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，抑制神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元，而當(dāng)Hes1的表達(dá)減弱時(shí)，則可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化，因此，Hes1在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[17]。Grandbarbe[18]研究指出，Notch信號(hào)通路抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化，而促進(jìn)其向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，而星形膠質(zhì)細(xì)胞又可以通過(guò)Jagged1介導(dǎo)的Notch信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)再生發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用[19]。Dias[20]等發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后抑制Notch信號(hào)通路可以加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的再生。

3.2 關(guān)于回醫(yī)烙灸療法 回醫(yī)烙灸療法是一種強(qiáng)刺激療法，它結(jié)合腧穴組織特點(diǎn)和經(jīng)絡(luò)功能，利用藥物、器械加熱所產(chǎn)生的火熱刺激，通調(diào)氣血，直接或間接地激發(fā)人體內(nèi)的潛能，通過(guò)皮膚和血管感受器的反射途徑傳到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)興奮和抑制過(guò)程。其通過(guò)擴(kuò)張血管，調(diào)節(jié)循環(huán)，增強(qiáng)局部耐受性及機(jī)體抵抗力[21]。而脊髓損傷后期氣血不調(diào)，經(jīng)絡(luò)堵塞造成肢體活動(dòng)不利。治療正需要回醫(yī)烙灸強(qiáng)刺激手段，刺激周?chē)窠?jīng)的敏感度，加強(qiáng)其與大腦中樞神經(jīng)的聯(lián)系。它比“化膿灸”療法操作更加精準(zhǔn)，且對(duì)皮膚的損傷程度較輕，對(duì)元?dú)獾恼駣^與恢復(fù)更加迅速[22]。回醫(yī)在長(zhǎng)期臨床使用中證實(shí)，烙灸療法對(duì)于經(jīng)絡(luò)、筋經(jīng)的不暢，骨與關(guān)節(jié)損傷性疾病有不可替代的獨(dú)特療效。該特色療法在長(zhǎng)期的傳承和應(yīng)用中，積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，治療效果可靠，對(duì)醫(yī)療設(shè)備設(shè)施的依賴(lài)小，技術(shù)操作便于掌握，適合在基層推廣。

3.3 回醫(yī)烙灸療法對(duì)脊髓損傷大鼠Notch信號(hào)通路中Presenilin1、Hes1蛋白表達(dá)的影響 觀察不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠損傷局部Presenilin1、Hes1表達(dá)情況，正常組大鼠脊髓組織中的Presenilin1、Hes1表達(dá)均沒(méi)有變化，表明回醫(yī)烙灸療法對(duì)假手術(shù)組大鼠脊髓組織中Notch信號(hào)沒(méi)有影響，在脊髓損傷后的1、7、14 d，模型組大鼠損傷局部的Presenilin1、Hes1表達(dá)有顯著升高，表明脊髓損傷可以激活大鼠損傷局部Notch信號(hào)通路，這可能與脊髓損傷后神經(jīng)組織的自我修復(fù)有關(guān)，并持續(xù)高表達(dá)至損傷后28 d，其持續(xù)的高表達(dá)可促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，但是也抑制內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的分化，這將不利于神經(jīng)組織的修復(fù)，同時(shí)其高表達(dá)也促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度增生，過(guò)度增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞將會(huì)促進(jìn)膠質(zhì)瘢痕的形成，從而進(jìn)一步阻礙神經(jīng)功能的修復(fù)。而不同時(shí)間點(diǎn)西藥組、2 h烙灸組、6 h烙灸組大鼠脊髓組織中受損局部Presenilin1、Hes1的表達(dá)都較模型組顯著降低，烙灸組降低幅度最大，且2 h烙灸組最顯著。結(jié)果顯示，回醫(yī)烙灸療法通過(guò)抑制脊髓損傷大鼠局部Presenilin1、Hes1的表達(dá)，從而抑制Notch信號(hào)通路的表達(dá)，使Notch信號(hào)通路被抑制，不但促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化，而且還抑制了內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞過(guò)度分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，以促進(jìn)其局部神經(jīng)的修復(fù)，且前期烙灸干預(yù)的效果好于后期干預(yù)。