外泌體在肝癌中的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景

徐先云，嚴(yán) 俊,2,3,4，李 汛，2，3,4*

(1.蘭州大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000; 2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 普外五科，甘肅 蘭州 730000;3.甘肅省生物治療與再生醫(yī)學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730022; 4.甘肅省肝膽胰研究所，甘肅 蘭州 730000)

肝癌是病死率較高的惡性腫瘤，它的發(fā)病率在所有腫瘤中位于第四位，致死率位列第三位[1]，因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療對肝癌患者預(yù)后具有十分重要的意義，近年來，越來越多的研究表明外泌體(exosome)在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥性等方面發(fā)揮著重要作用，有望在外泌體研究中發(fā)現(xiàn)敏感性及特異性均較高的肝癌早期診斷標(biāo)志物。本文將從外泌體與肝癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、診斷及治療等方面的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體的生物學(xué)特性

外泌體最早發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞上清液中，是由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合后釋放到體液中膜性囊泡，外形為圓形或橢圓形，直徑在30～100 nm，其內(nèi)包涵物質(zhì)豐富，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA、miRNA和DNA片段等多種物質(zhì)，在人體生理病理過程中發(fā)揮著重要作用，參與細(xì)胞間通訊、血管再生、細(xì)胞遷移、免疫應(yīng)答及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。多種細(xì)胞均可以分泌外泌體，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等；目前研究發(fā)現(xiàn)幾乎可以在任何體液中檢測到外泌體的存在，如血液、唾液、肺泡灌洗液、乳汁、羊水、胸腹腔積液、陰道灌洗液和尿液等體液中[3- 6]。外泌體內(nèi)涵豐富，其內(nèi)容物并不是由細(xì)胞隨機裝配而分泌到細(xì)胞外環(huán)境中，外泌體的分泌受到細(xì)胞的精細(xì)調(diào)節(jié)，其內(nèi)容物反應(yīng)了來源細(xì)胞的功能，從而實現(xiàn)細(xì)胞間的各種信息及物質(zhì)交換；最新研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞所分泌的外泌體其表面蛋白整合素參與外泌體的靶向分泌的過程[7]；腫瘤細(xì)胞外泌體的靶向分泌，使腫瘤細(xì)胞與周圍組織細(xì)胞實現(xiàn)定向物質(zhì)和信息交換，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及化療免疫。

2 外泌體與肝癌的發(fā)生發(fā)展

相關(guān)研究表明外泌體與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)系，甚至在抑制腫瘤方面也發(fā)揮著重要作用。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可協(xié)助腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞及物質(zhì)交換，促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的形成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的增殖及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；同時腫瘤細(xì)胞所分泌的外泌體可抑制免疫細(xì)胞的增殖并促進(jìn)免疫細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而大大減少免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，促進(jìn)腫瘤免疫耐受。另一方面，免疫細(xì)胞所分泌的外泌體，其包含多種腫瘤細(xì)胞殺傷物質(zhì)，這些物質(zhì)在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時可進(jìn)一步激活其他免疫細(xì)胞，從而產(chǎn)生更強烈的腫瘤殺傷作用。

2.1 外泌體與肝癌增殖及抑制

在腫瘤發(fā)生、發(fā)展這過程主要由原癌基因的激活及抑癌基因的沉默所導(dǎo)致的，腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間通過外泌體進(jìn)行信息傳遞及物質(zhì)交換，從而形成特定腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖；有研究表明腫瘤分泌的外泌體可促進(jìn)特定的癌基因在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[8]。另一相關(guān)研究顯示肝癌細(xì)胞來源的外泌體，因攜帶大量肝癌特異性抗，可激發(fā)更強烈的腫瘤免疫反應(yīng)；肝癌細(xì)胞所分泌的外泌體可有效增加樹突狀細(xì)胞激活，同時增加T淋巴細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而提高γ干擾素表達(dá)水平，并降低腫瘤部位的白細(xì)胞介素- 10及腫瘤生長因子β表達(dá)水平，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖[9]。

2.2 外泌體與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移

腫瘤分泌的外泌體在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境及遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)運起著關(guān)鍵的作用，進(jìn)而實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤實現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，一方面是從破壞細(xì)胞外基質(zhì)基底膜開始，細(xì)胞外基質(zhì)基底膜的生成與分解受到金屬蛋白酶的調(diào)控，而腫瘤來源的外泌體可促進(jìn)金屬蛋白酶的生成，從而作用于細(xì)胞外基質(zhì)基底膜加速其分解，使腫瘤細(xì)胞突破基底膜，實現(xiàn)腫瘤的侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；另一方面，腫瘤細(xì)胞通過發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(指細(xì)胞失去上皮細(xì)胞特性從新獲得間質(zhì)細(xì)胞特性)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表型和形態(tài)轉(zhuǎn)變，進(jìn)而實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，相關(guān)研究表明外泌體與腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化具有密切關(guān)系。MAPK信號通路的激活，可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并且上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)和MMP2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌的外泌體含有miRNA- 320a可直接結(jié)合其下游靶受體pbx3，miRNA- 320a-pbx3通路可抑制MAPK信號通路的激活，所以miRNA- 320a具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力；相關(guān)研究表明肝癌患者中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌的外泌體中miRNA- 320a明顯減少，所以miRNA- 320a水平下降與肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系[10]。

3 外泌體在肝癌中的應(yīng)用

由于外泌體所攜帶蛋白、脂質(zhì)和miRNA等具有母細(xì)胞特性，幾乎可從任何體液中得到，而且具有磷脂雙分子層模性結(jié)構(gòu)，能很好地保護(hù)其內(nèi)容物不被破壞，近年研究表明外泌體所攜帶的腫瘤來源的物質(zhì)，可用于腫瘤的早期診斷、耐藥性檢測、預(yù)后評估及治療[11]。

3.1 外泌體與肝癌的診斷

目前肝癌的診斷主要分為兩大類技術(shù)，一類主要以影像學(xué)檢查為主，包括超聲、CT和MRI等；另一類主要以實驗室診斷性標(biāo)志物檢測為主，包括AFP等；但上述檢測方法均無法對肝癌微小病灶和早期肝癌做出明確診斷。現(xiàn)階段AFP已經(jīng)被作為肝癌診斷標(biāo)志物在臨床廣泛應(yīng)用，但在早期肝癌患者中單獨使用AFP作為診斷標(biāo)志物的假陽性率高達(dá)40%,在晚期肝癌患者中有15%～30%的患者AFP仍處于正常水平[12]。因此迫切需要尋找新的可以代替AFP或者聯(lián)合AFP等腫瘤標(biāo)志物的診斷標(biāo)志物，來提高早期肝癌的篩查和診斷準(zhǔn)確性。研究證明外泌體中許多肝癌特異性miRNA可用于肝癌的早期診斷。相關(guān)研究表明慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌患者的血清外泌體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)血清外泌體中miRNA- 18a、miRNA- 221、miRNA- 222、miRNA- 18a和miRNA- 224的表達(dá)肝癌患者明顯高于慢性乙型肝炎和肝硬化患者，外泌體中miRNA- 101、miRNA- 122表達(dá)肝癌患者比慢性乙型肝炎患者低，在3組患者外泌體中miRNA- 21和miRNA- 93表達(dá)水平無顯著性差異，而在血清中3組患者miRNA的表達(dá)水平無明顯差異，提示外泌體中特異性mi-RNA可作為肝癌的診斷標(biāo)志物[13]。相關(guān)研究表明miRNA- 21在許多腫瘤的發(fā)生中均具有重要作用，可用于腫瘤的早期診斷，但在血液中miRNA- 21含量極少，不便于檢測，而在腫瘤分泌的外泌體中miRNA- 21含量明顯增高，在肝癌分泌的外泌體中miRNA- 21就具有很高的表達(dá)水平，檢測外泌體中的miRNA- 21為肝癌的早期診斷提供可能；miRNA- 21不具有肝癌特異性，如與AFP聯(lián)合進(jìn)行早期肝癌的診斷，可明顯提高其診斷率[14]。有研究表明miRNA- 10b被證實在肝癌組織中表達(dá)，且高度表達(dá)提示預(yù)后不良，miRNA- 10b相比于miRNA- 21在早期肝癌的診斷更具有價值；miRNA- 10b、miRNA- 200A和miRNA- 122與肝硬化的形成具有密切關(guān)系，其具有很強調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，進(jìn)而促進(jìn)肝硬化的形成；因此在肝硬化相關(guān)肝癌的診斷miRNA- 10b、miRNA- 200A和miRNA- 122作為診斷標(biāo)志物具有很好地敏感性及特異性[15]。

3.2 外泌體與肝癌的治療

間充質(zhì)干細(xì)胞具有分泌大量外泌體的能力，相關(guān)研究將間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA- 122和miRNA- 199，使其分泌含有miRNA- 122和miRNA- 199的外泌體，在將外泌體與HUh7肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)，再在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入5-氟尿嘧啶(5-FU)，發(fā)現(xiàn)加入含有miRNA- 122和miRNA- 199的外泌體的HUh7肝癌細(xì)胞對5-FU的敏感性明顯增高，Huh7肝癌細(xì)胞增殖速度明顯降低凋亡速度加快；在動物模型中發(fā)現(xiàn)將通過輸注帶有miRNA- 122的間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體進(jìn)行腫瘤原位的注射能有效增加化療藥物的抗腫巧效果[16]。同樣相關(guān)研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可以促進(jìn)NK細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)，從而促進(jìn)NK細(xì)胞對肝癌的抑制[17]。相關(guān)研究表明通過MS-275(恩替諾特)作用過的外泌體可有效增加NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性通過上調(diào)MICA、MICB和HSP70的表達(dá)，進(jìn)而增加NK細(xì)胞的抗腫瘤作用，所以MS- 275被認(rèn)為是一種潛在的抗肝癌藥物。

3.3 外泌體與肝癌的化療耐藥性

肝癌對常規(guī)化療有很高的耐受性，而miRNA- 122對促進(jìn)肝癌細(xì)胞化療敏感性具有重要作用，有效載體介導(dǎo)的miRNA- 122傳遞可能是肝癌化療的一種策略。越來越多的興趣集中在外泌體作為miRNA生物轉(zhuǎn)移載體。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)因具有分泌大量外泌體的能力，相關(guān)研究將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA- 122表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染miRNA- 122表達(dá)質(zhì)粒的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠有效地包裝并分泌含有miRNA- 122的外泌體，進(jìn)而作用于肝癌細(xì)胞，從而使肝癌細(xì)胞中對化療藥物敏感性的miRNA- 122-target基因表達(dá)發(fā)生變化，進(jìn)而增加化療藥對肝癌的抗腫瘤作用[18]。相關(guān)研究表明索拉菲尼和鏈霉素化療藥物作用于肝癌細(xì)胞時，可引起肝癌細(xì)胞高表達(dá)linc-RNA ROR和linc-RNA VLDLR(肝癌細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)時所產(chǎn)生的一類長鏈非編碼RNA)，并高度富集于肝癌細(xì)胞所分泌的外泌體中，而linc-RNA ROR和linc-RNA VLDLR已證實可明顯減弱化療藥物對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性及細(xì)胞凋亡作用，進(jìn)而減少肝癌對化療藥物的敏感性[19]。相關(guān)研究表明肝癌細(xì)胞分泌的外泌體可有效提高肝癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性，其可通過激活HGF/c-Met/Akt信號通路(HGF/c-Met/Akt通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著非常重要的角色，并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移)進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的凋亡[20]。

3.4 外泌體與肝癌的復(fù)發(fā)

相關(guān)研究表明外泌體在肝癌的復(fù)發(fā)過程中也發(fā)揮著重要作用，肝癌患者肝移植治療后，發(fā)現(xiàn)肝移植后復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)的肝癌病例的血清外泌體中miRNA- 718表達(dá)存在顯著差異，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者血清外泌體中miRNA- 718呈低表達(dá)，未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者血清外泌體中miRNA- 718呈高表達(dá)，進(jìn)一步說明miRNA- 718的低表達(dá)與肝癌的侵襲性具有相關(guān)性，其低表達(dá)與肝癌預(yù)后不良密切相關(guān)[21]。

4 問題與展望

外泌體作為一類細(xì)胞間信息及物質(zhì)傳遞的載體，已越來越受到人們關(guān)注，其在許多疾病的發(fā)生及發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用，對外泌體的進(jìn)一步研究有助于對相關(guān)疾病提早診斷，預(yù)測相關(guān)疾病發(fā)生及發(fā)展方向，及相關(guān)疾病的治療。外泌體與肝癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系，對于肝癌的早期診斷及治療具有重要意義。但目前為止外泌體在肝癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的具體機制仍未研究清楚，許多問題仍未很好地解決，如外泌體與受體細(xì)胞靶向結(jié)合的機制尚不明確，有待進(jìn)一步研究；在肝癌發(fā)展的不同階段其所分泌的外泌體內(nèi)容物是否相同，是否可通過人為干預(yù)逆轉(zhuǎn)其癌變過程。在肝癌的診斷方面，外泌體中所包含的許多miRNA仍具有很大的研究潛力，可為肝癌的早期診斷提供新的思路；在外泌體與肝癌的侵襲及轉(zhuǎn)移方面，對其作用機制及相關(guān)分子通路的進(jìn)一步研究，可有助于肝癌患者預(yù)后的評估，為新一代抗癌藥物的作用靶點提供新思路；在肝癌的治療方面，進(jìn)一步研究外泌體與肝癌耐藥性形成的相關(guān)機制，可提前避免肝癌細(xì)胞形成耐藥性，從而可大大提高患者治療效果；另一方面外泌體作為一種靶向的生物載體，可實現(xiàn)抗癌藥物的靶向運輸，進(jìn)而大大提高抗肝癌藥物的抗癌作用，同時可減少許多不必要的全身化療反應(yīng)。總之，外泌體與肝癌的許多方面仍具有相當(dāng)大研究潛力。