聲動力療法引起的細胞自噬在腫瘤和動脈粥樣硬化中的研究進展

李 賀，田 野,2，田 振*

(1.哈爾濱醫科大學 基礎醫學院 病理生理教研室， 黑龍江 哈爾濱 150081；2.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院 心血管內科， 黑龍江 哈爾濱 150001)

聲動力療法(sonodynamic therapy，SDT)是利用超聲波對生物組織有較強的穿透能力，無創傷地將聲波傳播到深部組織，并激活組織吸收的聲敏藥物(如血卟啉)而產生一系列生物學效應。單獨使用血卟啉或超聲對小鼠的腫瘤生長無明顯抑制作用，然而血卟啉聯合超聲(即SDT)卻具有很好的協同殺傷腫瘤效應[1]。SDT能夠誘導體外培養的巨噬細胞發生凋亡，對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊也有顯著的療效[2]。目前，SDT誘導細胞凋亡的能力被普遍認可[3]，然而僅僅通過凋亡機制并不能完全解釋SDT的治療作用。近年來，研究發現SDT還可以通過促進細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成而增加細胞自噬[4]。

細胞自噬是真核細胞中特有的一種高度保守的細胞自身內容物降解過程，通過細胞自噬泡包裹內源性細胞成分 (如氨基酸、 游離脂肪酸和核苷酸等)

并經過溶酶體途徑降解，藉此滿足細胞本身的代謝需要和完成某些細胞器的更新[5]。研究發現細胞自噬功能紊亂與多種疾病的發生發展密切相關[6- 7]。闡明SDT與細胞自噬的關系將為指導疾病的治療提供理論依據。

1 細胞自噬

1.1 細胞自噬的作用

在正常生理條件下，細胞自噬具有維持氨基酸池的穩態、抗衰老、抑制腫瘤、清除胞內微生物和調節免疫等重要功能。而在刺激條件下，如生理性應激刺激(如缺氧和內質網應激)、激素刺激、藥物(如雷帕霉素)、固有免疫信號和疾病(如微生物感染和心臟病)等，細胞自噬水平要明顯高于基礎水平。此外，細胞自噬功能在神經退行性疾病、感染疾病和衰老等疾病中也可能會降低。

1.2 細胞自噬的過程

細胞在刺激作用下，小的囊泡形成杯狀分離膜(也稱吞噬泡)，延長并隨后包裹部分細胞質和細胞器，最終形成雙層膜結構——自噬小體(autophagosome)。自噬體外膜與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)。被吞噬的物質和自噬溶酶體內膜在水解酶和強酸的環境下變性并被降解為氨基酸、脂肪酸、碳水化合物和核苷酸，隨后運送到細胞質供細胞重新利用[8]。超過30種自噬相關基因(autophagy-associated gene，ATG)編碼的蛋白參與了吞噬泡延伸、自噬體與溶酶體的融合過程[9- 10]。細胞自噬是一個比較復雜的動態過程，因此僅僅檢測微管相關蛋白(LC3-Ⅱ)和beclin- 1等蛋白的改變并不能完全說明細胞自噬的真實變化。目前,還沒有一種特別簡潔有效的方法能夠直觀的反應細胞自噬的變化，所以需要透射電鏡、免疫印跡和熒光標記等多種檢測手段同時使用，增加結論的可靠性。

2 SDT誘導細胞自噬的機制

SDT是在光動力療法(photodynamic therapy，PDT)理論與技術的基礎上演變而來的，在腫瘤和動脈粥樣硬化疾病的治療研究中取得了良好的效果[11]。目前，研究認為ROS的產生可能是SDT發揮作用的基本機制。ROS對細胞具有廣泛的作用，例如，ROS能引起細胞凋亡，也能引起細胞自噬。

2.1 SDT通過產生ROS引起細胞自噬

SDT的影響因素較多，主要包括聲敏劑種類、超聲參數、細胞類型和實驗條件(如氧氣濃度等)等。由于這些不確定因素和研究手段的限制，對SDT的機制的研究面臨巨大挑戰。目前比較公認的SDT機制之一是超聲空化作用。超聲波產生的小氣泡(空化泡)會隨著周圍的液體的振動而不斷運動、膨脹甚至潰滅。空化泡潰滅時會導致大量ROS的產生。聲敏劑在這一過程中起到載體的作用[12]。

SDT可以短時間內產生ROS，ROS瞬時就會被分解，然而部分文獻中的ROS高峰卻是在SDT結束后1～2 h[13]。SDT時，細胞內ROS的增多可能與多種因素有關，例如SDT直接可產生ROS，同時細胞內線粒體也可以產生ROS，另外細胞的抗氧化能力也可能下降。因此，SDT所引起的ROS升高有可能是SDT直接產生的，也可能是細胞功能與代謝狀態改變而間接產生的。SDT促進ROS升高的確切機制仍需要更多的后續研究進行闡明。

在SDT前使用ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預處理培養的巨噬細胞，SDT引起的細胞自噬被顯著抑制[13]。該結果說明SDT可以引發細胞自噬，而產生的ROS可能是引起細胞自噬的重要因素。

2.2 SDT引起細胞自噬的信號通路

SDT提高細胞內ROS的含量，通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路激活細胞自噬。SDT可以顯著提升細胞LC3-Ⅱ和beclin- 1的蛋白表達水平，降低p-AKT、p-mTOR和P62蛋白表達水平，在透射電鏡下可以清晰的觀察到自噬體的獨立雙層膜結構。分別使用PI3K抑制劑、AKT抑制劑和mTOR抑制劑預處理巨噬細胞, 明顯降低細胞p-AKT、p-mTOR和P62的表達水平，升高LC3-II和beclin- 1的表達[14]。此外，腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK)通路也部分參與了SDT誘導細胞自噬的過程。使用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和巴佛洛霉素A1(bafilomycin A1)等自噬抑制劑, 阻斷自噬流，SDT引起的降低炎性反應和促進脂質代謝的作用消失[13]，說明細胞自噬在SDT治療動脈粥樣硬化疾病中可能發揮重要作用。

3 SDT引起的細胞自噬對疾病的影響

細胞自噬在不同的疾病中可能發揮不同的作用，其具體作用與疾病的發病機制有密切關系。例如，細胞自噬增高可能會有利于腫瘤細胞的生存[4, 15]，但卻具有抗動脈粥樣硬化進展的作用[16- 17]。

3.1 細胞自噬與腫瘤

SDT最早的應用于治療腫瘤，可以特異性的造成癌細胞凋亡和壞死，但同時也會引起細胞自噬的發生[4, 18]。

細胞自噬最初被認為是一種促存活機制，在不利的環境下促進細胞存活，但最近的研究表明誘導細胞自噬也可以導致細胞死亡，被稱為自噬性死亡(Ⅱ型程序性細胞死亡)。自噬既能通過抑制凋亡通路而延緩細胞凋亡[19]，也能作為一種程序性死亡方式導致細胞死亡[20]。因此，探討SDT誘導的細胞自噬對殺傷腫瘤細胞的影響，可以為提高抗腫瘤效率提供依據。

小鼠淋巴細胞白血病L1210細胞在SDT治療0.5 h后細胞自噬被活化。使用自噬抑制劑增加SDT誘導L1210細胞凋亡[21]，結果說明了在SDT治療L1210細胞中，細胞自噬的作用不是誘發自噬性死亡，而是抑制凋亡的發生。

綜上所述， SDT引起的細胞自噬通過對抗SDT的殺傷作用而促進腫瘤細胞的存活，為治療腫瘤增加難度。因此，未來可嘗試使用SDT聯合自噬抑制劑，可能會增強抗腫瘤的臨床效果。

3.2 細胞自噬與動脈粥樣硬化

提高細胞自噬水平對動脈粥樣硬化有一定治療意義[22]。動脈粥樣硬化是一種慢性炎性反應疾病，在早期和發展期單核巨噬細胞參與炎性反應并分泌各種炎性反應因子。炎性反應活化能導致蛋白酶分泌、組織破壞和斑塊破裂。使用SDT可以明顯減少巨噬細胞白介素- 1β(IL- 1β), 白介素- 12(IL- 12)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達和分泌。單純超聲和單純聲敏劑對細胞無明顯影響。使用自噬抑制劑和ROS清除劑可逆轉這種改變[14]。細胞自噬能降低巨噬細胞的炎性反應，然而是否有炎癥體自噬降解途徑的參與目前還不甚清楚。

隨著動脈粥樣硬化的進展，巨噬細胞吞噬氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)，其細胞自噬功能損傷，導致斑塊內脂質負載和脂質無法降解[23]。SDT促進轉錄因子TFEB核轉位使溶酶體再生，提高細胞自噬，從而抑制脂質攝取，增加脂質流出。TFEB是一種重要的轉錄因子參與細胞內調控多種脂質降解相關基因的表達。SDT后腺苷三磷酸結合盒轉運體A1(ABCA1)表達水平升高，增加了脂質流出；跨膜的白細胞分化抗原36(CD36)和清道夫受體A(SR-A)表達降低，抑制脂質攝取，從而達到疾病治療的效果[13]。

4 SDT誘導細胞自噬的優勢

SDT誘導細胞自噬具有常規藥物與PDT不可比擬的優勢，該療法具有靶向性強、穿透性深、精準和副作用小等特點。

4.1 靶向性強

借助聲敏劑的組織特異性吸收及超聲波的聚焦控制可實現較高的靶向性。例如，腫瘤具有高代謝特點，可以比正常組織吸收更多的聲敏劑。同時借助超聲治療儀可以將超聲的能量聚集在局部區域。因此，聲敏劑和超聲的雙重特異性使得SDT調控細胞自噬具有很強的靶向性。

4.2 穿透性深

PDT穿透深度有限，無法到達人體深部組織，這決定了PDT只能治療表淺的病灶，如皮膚病和乳腺癌等。SDT所使用的超聲是機械波，波長較長，在人體組織傳播時，傳播能量損失小，所以傳播距離大，穿透能力強，可用于心血管疾病或體內較深的腫瘤的治療。

4.3 精準性高

根據疾病的特點，精確調節自噬的程度有助于疾病的治療和康復。隨著醫學不斷的發展和科技水平的提升，對疾病的治療不再是一概而論，而是在治療方案中漸漸重視個體之間的差異，即精準醫學。而利用超聲儀器可以根據不同個體的組織聲敏劑濃度、氧濃度和聲場分布等特性而調節治療的時間、超聲的強度和頻率等參數，符合精準醫療的理念。

4.4 其他優勢

當前，腫瘤治療的常規的方法是手術治療，不但費用昂貴和操作復雜，而且安全性低，預后較差。SDT是一種無創的治療方法，對人體的損傷程度很輕，并且可以對手術不耐受的患者進行治療。

5 問題與展望

SDT作為一種新興的治療技術，其引起的自噬對腫瘤和動脈粥樣硬化等疾病的治療具有重要影響。SDT對細胞自噬的調控具有靶向性強和穿透性深等優勢。然而，已有的研究仍存在許多不足之處。首先，目前的結果都是基于體外研究，未來可以更多的采用在體研究，探究SDT對機體的作用；其次，研究內容單一，未來可應用分子生物學，組學和生物信息學深入挖掘SDT調控自噬的機制以及細胞自噬的作用。總之，SDT的作用和具體機制仍需進一步研究。相信不久的將來，SDT可以作為一種新的治療手段，為臨床服務。