相關性miRNAs在骨肉瘤中作用的研究進展

趙 珂，王文己，韓興文

(1.蘭州大學 第一臨床醫學院 蘭州 730000；2.蘭州大學第一附屬醫院 骨科 蘭州 730000)

骨肉瘤(OS)是起源于間葉組織的惡性腫瘤，好發于兒童和青少年長骨的干骺端，以股骨遠端及脛骨近端最為常見；發病率約為4.4/100萬，在原發性骨腫瘤中排第二位[1]。骨肉瘤以產生骨樣組織的梭形基質細胞為特征。目前骨肉瘤的治療以新輔助化療和手術治療為主，即便化療方案的不斷完善，以及影像學發展帶來的腫瘤邊界判斷和病情檢測水平的提高，其5年生存率仍然維持在60%～70%水平，無明顯提高[2]。

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類長度約18～25個核苷酸的非編碼RNA小分子，能夠在轉錄后內源性調控基因表達。腫瘤機制研究發現；miRNAs參與到腫瘤發生發展和轉移等不同階段，并密切相關[3]。骨肉瘤的發病機制與基因突變、信號通路激活異常、miRNAs以及長鏈非編碼RNA的異常調控等諸多方面有關[4]。故而對miRNAs在骨肉瘤中作用的研究對骨肉瘤診斷與治療提供了新的研究方向。本課題組研究發現，Wnt信號通路異常激活促進骨肉瘤細胞的轉移侵襲。而miRNAs與Wnt信號通路異常激活密切相關。本文對miRNAs在骨肉瘤發生發展、轉移以及在血清學層面等方面的研究進展作一簡要綜述。

相關性miRNAs在骨肉瘤中作用的研究進展

1 相關miRNAs在骨肉瘤中的差異性表達

骨肉瘤來源于多能干細胞(間質干細胞)，而非分化異常的成骨細胞。間質干細胞在向骨細胞分化的過程中出現基因遺傳學的改變而分化成異常的骨肉瘤細胞[5]。目前的研究已證實，miRNAs在腫瘤細胞內表達存在明顯差異性。與正常細胞相比，相關miRNAs表達水平出現增高或降低，同時大量研究結果揭示相關性miRNAs在骨肉瘤組織細胞內表達水平的上升與下降與骨肉瘤發生發展等進程密切相關，miRNAs表達譜的差異性分析為相關性miRNAs在骨肉瘤中作用的闡述提供了依據。

近期1項研究發現，骨肉瘤細胞中染色體14q32區的miR- 369- 3p、miR- 382、miR- 134和miR- 127- 3p表達減少，miR- 17- 5p、17- 3p、18a和19a表達增加[6]。另1項關于miRNA- 145在骨肉瘤中的表達情況的實驗中，通過RT-qPCR技術檢測166例骨肉瘤組織及正常無瘤骨組織中miR- 145的表達水平，結果顯示，與正常無瘤骨組織相比，miR- 145在骨肉瘤組織中的表達明顯下調。166組標本根據miR- 145表達水平的高低分為兩組，統計學分析表示，miR- 145相對高表達的患者多處于臨床早期，腫瘤無明顯遠處轉移，且對化療敏感，總體生存期更長；而miR- 145低表達的患者多處于臨床晚期，腫瘤多伴有明顯遠處轉移，同時對化療效果差，總體生存期更短[7]。這是第一次有明確證據證明miR- 145的低表達與骨肉瘤的轉移及化療抵抗相關，miR- 145有望成為判斷骨肉瘤預后的獨立標志物及靶向治療的靶點。在1項關于3AB-OS骨肉瘤細胞株中189種miRNAs的表達情況的實驗中，發現152種miRNAs表達水平與正常細胞相比出現明顯差異，其中46個具有明顯差異的miRNAs及其受其調控的靶基因與細胞增殖、分化和凋亡，以及Wnt和MAPK等信號通路密切相關[8]。

2 miRNAs與骨肉瘤的發生發展

miRNAs已經成為目前骨肉瘤分子生物學研究的熱點及重點。miRNAs在骨肉瘤中作用的研究才剛剛起步，一些miRNAs在骨肉瘤發生發展中的一些調節機制及相應靶點已被發現。部分miRNAs促進了腫瘤的發生發展，而部分則起抑制作用。這些miRNAs的發現及機制的研究為骨肉瘤的研究開辟了新的鄰域。

2.1 促進骨肉瘤發生發展的相關miRNAs

在骨肉瘤細胞組織中，起致癌作用的miRNAs通常表達上調，其靶向抑制抑癌基因的表達而促進腫瘤的發生發展。近期1項實驗研究中，miR- 21被轉染至U2OS和MG- 63兩種骨肉瘤細胞系中，發現骨肉瘤細胞系細胞增殖能力較未轉染的對照組明顯增強；同時轉染反義miRNA- 21的細胞其細胞增殖能力受到顯著抑制。人骨肉瘤細胞增殖過程中miRNA- 21是通過抑制反轉錄富含半胱氨酸(RECK)蛋白的表達,進而介導骨肉瘤細胞的表型轉換。miR- 21的異常高表達抑制了RECK的抑癌作用，而促進了癌細胞的增殖[9]。另1項關于miRNA- 421在骨肉瘤中作用研究發現，miRNA- 421在骨肉瘤中的表達明顯高于癌旁正常組織；過度高表達的miRNA- 421通過抑制抑癌基因MAP2K4起促進MG- 63細胞增殖、遷移、侵襲的作用；同時臨床研究也表明與低表達的患者相比，血清中高表達的骨肉患者總體生存期更短[10]。

2.2 抑制骨肉瘤發生發展的相關miRNAs

在骨肉瘤細胞內，起抑癌作用的miRNAs通常表達下調，而其抑癌作用的機制研究為骨肉瘤基因治療提供潛在的靶點。1項研究發現，與瘤旁組織相比，原發性骨肉瘤組織中，miRNA- 143呈現明顯低表達；而將miRNA- 143轉染至MG- 63細胞株后，發現miRNA- 143后誘導細胞G1期阻滯，促進細胞凋亡[11]。在此基礎上，近期的1項分子生物學實驗發現，miRNA- 143的表達與抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤- 2蛋白(BCL- 2)的表達呈負相關；miRNA- 143直接靶向作用于BCL- 2蛋白，抑制其抗凋亡作用而發揮促凋亡作用[12]。miRNA- 143與BCL- 2之間的相互作用機制為骨肉瘤基因治療提供了潛在靶點。另1項關于miRNA- 130a在骨肉瘤中作用的研究發現，miRNA- 643在骨肉瘤組織及細胞中表達下調，而轉染miRNA- 130a的細胞增殖、侵襲能力顯著降低；miRNA- 643的直接作用靶點為癌基因ZEB1，抑制ZEB1能起到與miRNA- 130a相同的作用[13]。由此可見，miRNA- 130a靶向作用ZEB1而起抑癌基因的作用，miRNA- 643與ZEB1之間復雜的作用關系可成為骨肉瘤的潛在治療靶點。

總之，大量的miRNAs研究已證實，部分miRNAs促進了骨肉瘤的發生發展；同時一部分miRNAs則起抑制作用[6，14]。但是，目前miRNAs對骨肉瘤的調控的具體機制研究才剛剛起步，促癌基因與抑癌基因之間相互的作用關系，以及促/抑癌基因與其相對應的靶基因之間相互作用的機制構成的復雜調控網絡仍待進一步發掘與研究。

3 miRNAs與骨肉瘤的轉移

骨肉瘤早期就會出現遠處轉移，且以肺轉移為主，病情惡化迅速，病死率較高。確診骨肉瘤時，約有半數的患者已出現不同程度的肺轉移。單純的手術治療無法避免骨肉瘤的遠處轉移，而且骨肉瘤一旦發生肺轉移，其5年生存率在20%～ 25%[16]。而近年來的研究指出，大量的miRNAs與腫瘤細胞轉移相關的細胞運動、胞間黏附、細胞與基質之間的相互作用密切相關[17]。因此，研究與骨肉瘤遠處轉移相關，特別是與肺轉移相關的miRNAs以及其相對應的靶基因并調控機制，對控制骨肉瘤遠處轉移特別是肺轉移的靶向治療以及改善患者術后，提高患者生存率具有重大意義。

肺轉移是血道轉移最常見的部位之一。骨肉瘤瘤體周圍豐富的血供及供養血管的形成是早期血道轉移發生的先決條件。而腫瘤細胞促進新毛細血管的生成與其分泌的腫瘤血管生長因子(VEGFA)密切相關。最近一項研究發現，骨肉瘤組織中miRNA- 1表達下調，并與VEGFA表達呈負相關，通過雙熒光素酶報告基因檢測顯示VEGFA是miRNA- 1的直接作用靶點；當siRNA敲除miRNA- 1后VEGFA表達上調并抑制U2OS細胞的遷移與體外遷移[18]。

Wnt通路機制在腫瘤細胞侵襲轉移中具有重要作用。本課題組經過體外細胞株實驗發現，使用Wnt通路阻滯劑(icrt- 14及XAV- 939)阻斷Wnt通路時，骨肉瘤MG- 63及U2OS細胞株增殖及遷移侵襲出現明顯的抑制，表明Wnt/β-catenin通路與骨肉瘤轉移密切相關。近期1項關于miRNA- 214的實驗研究發現，被轉染miRNA- 214的MG- 63及U2OS細胞株內Wnt通路的下游蛋白β-catenin表達異常上升，同時細胞遷移及體外侵襲能力均強于對照組[19]。由此可見miRNA- 214通過調節Wnt/β-catenin信號通路促進骨肉瘤細胞的侵襲轉移。而近期另1項研究發現，miRNA- 107在骨肉瘤組織中低表達，而DKK- 1表達上調；miRNA- 107通過調節Wnt/β-catenin通路下調DKK- 1的表達起抑制骨肉瘤細胞的增殖轉移[20]。上述兩項研究表明，miRNAs與骨肉瘤轉移機制相關信號通路的異常激活密切相關，這為靶向治療骨肉瘤轉移，提高患者生存率提供了靶點。

目前關于骨肉瘤細胞轉移侵襲相關的miRNAs研究才剛剛起步，促進轉移與抑制轉移的相關性miRNAs間相互作用的關系機制仍不十分清楚。大量與骨肉瘤細胞轉移相關的miRNAs正不斷被人們發現與研究，這為控制骨肉瘤細胞遠處轉移，提高患者生存率提供了新的靶點發方向。

4 外周血中miRNAs與骨肉瘤

4.1 外周血中miRNAs的表達與檢測方法

通過手術切除的腫瘤標本進行分子生物學檢查存在明顯局限性，因而患者外周血中核酸分子(CNA)的檢測成為了研究的熱點。大量研究發現，miRNAs不僅只存在于組織細胞內，在包括血清、血漿、唾液、尿液、精液及乳汁等各種體液或分泌物中都有發現[21]。而且外周血中的miRNAs在反復凍存-解凍，煮沸，過酸(pH=2)和過堿(pH=13)等條件下，均能保持濃度和生物活性穩定[22]，這為外周血中miRNAs替代組織標本成為新型檢測指標提供了依據。

目前miRNAs的檢測方法有：Northern印記雜交、RT-qPCR、基因芯片等技術，其中RT-qPCR應用最廣泛。PT-qPCR技術是指將熒光基因加入PCR反應體系中，利用熒光信號的積累來監測PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。該方法可區別前體miRNAs與成熟miRNAs。血液中miRNAs的檢測最常使用該種方法。

4.2 外周血中miRNAs在骨肉瘤中的意義

目前大量研究表明，檢測外周血中骨肉瘤相關mRNAs表達水平，為疾病早期診斷及病情進展監測提供了更加方便快捷的手段，具有重要意義。1項關于20例骨肉瘤患者以及20名健康對照者血清中miRNAs的表達譜的研究發現，miR- 106a- 5p、miR- 16- 5p、miR- 30a- 5p、miR- 425- 5p、miR- 45- 1a、miR- 25- 3p和miR- 139- 5p在骨肉瘤患者血清中呈現異常低表達。通過標準曲線分析這7種miRNAs表達有望成為骨肉瘤早期診斷、病情檢測的無創性標志物[23]。另1項關于骨肉瘤患者術前、術后及健康對照者血清中miRNA- 199a- 3p的表達水平的研究中，90名骨肉瘤術前患者和50例術后1月及90名健康對照血清中miRNA- 199a- 3p的表達水平顯示，骨肉瘤患者血清中miRNA- 199a- 3p的表達明顯上升，并且術后一月的患者血清中濃度較術前患者明顯下降，提示血清中miRNA- 199a- 3p有望成為骨肉瘤早期診斷與病情監測的新型指標[24]。與正常患者相比，骨肉瘤患者外周血中相關miRNAs組成和濃度的差異性表達為外周血中相關miRNAs成為骨肉瘤早期診斷、預后判斷和病情分析的無創性生物標志物提供了依據。

5 小結與展望

miRNAs與骨肉瘤的發生發展、侵襲轉移以及預后息息相關，并在其中發揮著重要作用。miRNAs在骨肉瘤組織細胞中的差異性表達為骨肉瘤早期診斷及治療提供新的作用靶點。通過研究藥物影響miRNAs在骨肉瘤細胞中的表達水平，進而影響腫瘤的病情進程與預后，為研究分子靶向類藥物治療骨肉瘤提供了新的方向。近年來，隨著大量miRNAs的發現，其生物合成、生物學功能、作用機制與疾病的相關性研究已取得一定的成果，特別是miRNAs在腫瘤疾病中的研究取得了很大的進展。但必須認識到miRNAs與骨肉瘤的研究還面臨很多的難題和空白。首先還有大量與骨肉瘤相關的miRNAs和靶基因，以及之間的功能與作用途徑未知；其次miRNAs與靶基因之間控制調節和多個miRNAs之間的相互調控以及反饋機制未知；還有miRNAs與骨肉瘤相關的各種信號通路之間作用關系，及多種miRNAs對一種信號通路的協調控制機制，以及反饋機制尚不明確?？傊琺iRNAs與骨肉瘤之間關系的探索為骨肉瘤臨床的早期診斷、分子靶向治療、預后判定提供了新的思路和挑戰。