外泌體在機體抗結核分枝桿菌感染中的作用及其應用

徐兆坤，李 武，王玉炯*

(1.寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川 750021；2.寧夏大學生命科學學院，銀川 750021)

結核病(tuberculosis)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)感染引起的人畜共患傳染病。據世界衛生組織估計，2015年，全球新增Mtb感染人數1 040萬，死亡人數140萬，另有40萬人死于Mtb和人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的雙重感染[1]。結核病的流行范圍之廣，危害之大，嚴重影響著人類公共衛生安全。然而，由于結核病的致病機制十分復雜，結核病的預防和治療工作仍面臨巨大的挑戰。所以，深入探究結核病的致病機制與機體抵抗結核病的免疫機制，實現結核病防治領域的重大突破，對減少因感染Mtb對人類健康帶來的危害，具有至關重要的作用。另外，建立適當的結核病預防診斷和治療的新方法也具有十分重要的現實意義。

外泌體是一種由細胞衍生的囊泡類結構，最早發現于20世紀80年代中期，開始時它是指在網織紅細胞成熟期間出芽產生的小囊泡，有清除多余膜結合蛋白的作用[2]。所以外泌體最初被認為是細胞的“廢棄物”，并未受到太多關注。然而后來有研究發現，這些小的胞外分泌泡并非只由網織紅細胞特異分泌，大多數哺乳動物細胞都可以釋放這種膜泡[3]。隨著研究的不斷深入，人們發現外泌體在多種疾病的發生發展中扮演了重要角色，在機體的免疫應答中也發揮著重要作用。近年來，越來越多的研究也發現，外泌體與Mtb的感染密切相關，本文將就外泌體在結核病發生發展及診療中的作用進行綜述。

1 外泌體

外泌體(exosomes)是一種由細胞衍生的囊泡類結構，其體積很小，直徑僅40～200 nm。外泌體可以由多種類型的細胞分泌，并可以從幾乎所有體液中分離出來，包括尿液、血漿、母乳、支氣管肺泡灌洗液、唾液、精液、羊水、腹水、關節液、母乳和腦脊髓液等[4-5]。外泌體內部包含有蛋白質、脂質、miRNA等多種分子。目前已經在不同物種的外泌體中鑒定出了4 563種蛋白質，194種脂質，1 639種mRNA和764種miRNA，其中膜轉運蛋白和融合蛋白是最常見的。還有一些外來蛋白質是外泌體共有的，其中包括四跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily, TM4SF)、CD63、CD81、CD9和熱休克蛋白(Hsp70)，這些蛋白質通常可以用作外泌體的標記物[6]。Mtb感染宿主細胞后，可以從外泌體中分離得到完整的分枝桿菌蛋白，包括Ag85B、HspX和許多其他分枝桿菌蛋白[3]?？ń槊?Bacille Calmette-Guérin, BCG)感染人單核細胞源性巨噬細胞(human monocyte-derived macrophages, MDMs)后，可以誘導其釋放外泌體，該外泌體中含有多種類型的miRNA[7-8]。2015年，Lee等[9]用LC-MS/MS技術從Mtb感染細胞分泌的外泌體中檢測到了287個蛋白，并發現其中有些與Mtb毒性有關。外泌體在生物液體中高度穩定，同時還包含各種與機體生理狀態相關的分子特征，因此可以通過提取外泌體分子內含物來獲得大量關于細胞生理和病理狀態的信息[10-11]。

隨著研究的不斷深入，外泌體的各種生物學功能開始為人所知。許多研究發現外泌體可以通過各種分子(包括從供體到受體細胞的miRNA)的往復傳遞而參與細胞間通訊[11]。由外泌體運送到靶細胞的外來miRNA可以顯著地影響靶細胞和受體細胞內的生化反應，從而影響細胞功能和病理狀態的發展。隨著研究的深入，人們開始意識到外泌體在免疫調節和細胞治療中發揮作用[12]。它們甚至可以作為疫苗載體在抗Mtb感染中發揮作用[13]。

2 外泌體在結核分枝桿菌感染中的作用

在外泌體日益引起廣泛關注的同時，越來越多的研究者開始將目光聚焦在結核病與外泌體之間的關系上。外泌體來源廣泛，內含物種類多樣，是獲取結核病病理信息的極佳來源。因此外泌體在結核病的發生發展中的作用吸引著越來越多科學家的關注。從目前的研究進展來看，外泌體在結核病發生發展中的作用總體來說有以下幾個方面。

2.1 提呈抗原信息

外泌體可以作為病原分子學模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)的載體，通過沉默或促進免疫應答進而影響受體細胞的生理狀態。早在1994年，科學家就發現了分枝桿菌在不同的細胞膜泡內運輸細菌內含物的現象，結果顯示釋放的囊泡具有將結核菌成分轉移到相鄰的未感染的巨噬細胞的能力[14]。Wang等[15]比較了巨噬細胞分泌的外泌體和用鳥分枝桿菌感染巨噬細胞后分泌的外泌體的成分，結果顯示，兩者外泌體中蛋白成分存在顯著的差異，后者兩種β-肌動蛋白亞型有所下調，而絲切蛋白(cofilin-1)上調。其研究結果還表明鳥分枝桿菌感染的巨噬細胞分泌的外泌體可能是鳥分枝桿菌抗原組分的載體，后者攜帶誘導促炎反應的分子糖肽脂，是細胞外抗原的重要來源。

Ramachandra等[16]研究證實，Mtb感染巨噬細胞后，巨噬細胞分泌的外泌體和囊泡中含有MHC-Ⅱ類分子，它們可以將抗原信息提呈給T細胞，并且它們可能比天然T細胞更有效地刺激記憶或活化的T細胞。這些機制可使結核分枝桿菌感染細胞分泌的囊泡運輸至離感染細胞更遠距離的細胞位點，并在這些位點刺激相關的T細胞發揮作用。已有研究發現，在Mtb感染的細胞所分泌的外泌體中宿主熱休克蛋白70(Hsp70)特異性增加[3, 17]，增加的Hsp70不僅可以促進細胞發生炎性反應，還可以加強巨噬細胞對恥垢分枝桿菌以及對鳥分枝桿菌的殺傷作用。這表明外泌體中除了含有外來抗原成分外，還含有宿主成分，說明外泌體在結核病的發生發展過程中，可以作為媒介在細胞間傳遞抗原信息，促進Mtb抗原的提呈[18]，對結核病的發生發展起著不可忽視的作用，但是與其他抗原呈遞機制相比，外泌體介導的抗原遞送以及激活免疫反應的機制需要進一步研究。

2.2 激活免疫細胞

除了具有提呈抗原的作用外，在結核病發生發展過程中，外泌體還具有激活免疫細胞的作用。帶有分枝桿菌成分的外泌體具有激活巨噬細胞的能力。Wang等[15]研究發現，鳥分枝桿菌和鳥分枝桿菌感染的巨噬細胞分泌的外泌體均可增強巨噬細胞中CD80和CD86的表達以及TNF-α和IFN-γ的分泌，可以引起靜息巨噬細胞產生免疫應答。隨后的研究進一步證實，從鳥分枝桿菌感染的巨噬細胞提取外泌體刺激巨噬細胞后，能增強巨噬細胞對葡聚糖的吞噬能力和巨噬細胞中CD40、CD80、CD81、CD86、HLA-DR，尤其CD195的表達，同時也能增強巨噬細胞中IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ和TNF-α的分泌[19]，說明外泌體具有活化巨噬細胞的作用。不僅如此，更多的研究還證實，外泌體還可以激活CD4+和CD8+T細胞，對獲得性免疫應答的形成具有重要作用[16]。Smith等[20]還發現被Mtb感染的小鼠巨噬細胞釋放的外泌體可以顯著影響T細胞應答，這意味著外泌體不僅可以在Mtb感染期間向免疫細胞呈遞抗原信息，還可以介導免疫系統的激活。Giri等[21]以J774為細胞模型，用Mtb刺激巨噬細胞后分離巨噬細胞分泌的外泌體，用LC-MS/MS從中鑒定出了41種Mtb抗原，包括許多眾所周知的Mtb抗原，包括抗原85A、B和C(Rv3804c，Rv1886c，Rv0129c)，MPT64(Rv1980c)和ESAT-6(Rv3875)，并用其中部分分泌性抗原刺激J774細胞，分離外泌體，體外試驗結果顯示，這些外泌體具有激活巨噬細胞、樹突狀細胞和初始CD4+和CD8+細胞的能力[21-22]。以上研究證實，外泌體對多種免疫細胞具有激活和活化作用，在宿主抵抗Mtb感染的過程中有著不可低估的影響。

2.3 調控機體免疫反應

除了提呈抗原和激活免疫細胞外，外泌體在結核病發生發展過程中可能還發揮其他作用。被Mtb感染的巨噬細胞所釋放的外泌體對保護性細胞免疫應答可能存在一定的抑制作用。有研究發現，Mtb感染巨噬細胞后，巨噬細胞分泌的外泌體可以阻礙天然巨噬細胞的INF-γ途徑的激活，抑制小鼠巨噬細胞表面MHC Ⅱ類和CD64分子的表達，這種抑制作用主要依賴于Toll樣受體2(TLR2)和髓樣分化因子88(MyD88)參與完成，從而對機體抗Mtb感染免疫產生一定的負面影響[23]。

還有研究發現，用BCG感染人單核細胞源性巨噬細胞(MDMs)可導致多種miRNA的釋放，主要包括Let-7家族成員，miR-155、miR-146a、miR-145和miR-21。這些miRNA都被預測為與免疫相關的重要靶向基因[24]。與未感染細胞相比，被Mtb感染的巨噬細胞分泌的外泌體中miRNA的含量有顯著變化，后者內含物中與psmb9、psmd3、psme2、cd74以及lgmn相關的轉錄產物水平明顯更高。除此之外在被Mtb感染后的巨噬細胞所得到的外泌體中還檢測到多種Mtb的轉錄產物，包括Rv0740、Rv0288、Rv1344、Rv0968、Rv1942c、Rv0664、Rv0190、Rv1757c和Rv1369c。這些轉錄產物可以轉移到其他細胞中并能正常翻譯成蛋白質。并且這些RNA可能參與受體細胞中免疫應答的調節并誘導受體細胞的細胞凋亡[25]。結核病的病變特征是形成典型的結核性肉芽腫，含有免疫原的外泌體可以被巨噬細胞和周圍的免疫細胞攝取，通過這種方式抑制IFN-γ途徑的激活，這有利于將Mtb擴散到未感染的細胞，這也就可以解釋長期觀察到的宿主細胞廣泛參與肉芽腫的現象[26]。以上研究說明，外泌體在結核病發生發展過程中，對宿主細胞還起到重要的免疫調節作用。

綜上所述，在結核病的發生發展過程中，外泌體可以作為媒介在細胞間傳遞細胞因子，促進Mtb抗原的提呈，外泌體還對多種免疫細胞具有激活和活化作用，尤其是對巨噬細胞的活化發揮重要的作用。當然，外泌體對免疫細胞的作用也不完全體現在對免疫細胞的激活上，還存在復雜的免疫調控作用，這說明外泌體在結核病發生發展的過程中作用的復雜性。

3 外泌體可作為結核病診斷中潛在的生物標志物

生物標志物(biomarker)是指可以檢測系統、器官、組織、細胞及亞細胞結構或功能的改變或可能發生改變的生化指標，它有助于對疾病發病狀況進行診斷評估。外泌體來源廣泛，內含物種類多樣，是獲取生物標志物的極佳來源，可以用于疾病的檢測，監視疾病的發展狀況[27]。結核病生物標志物的研究進展緩慢[28-30]。目前作為結核病常用的診斷方法主要有痰涂片顯微鏡方法檢查抗酸桿菌(acid fast bacilli, AFB)和結核菌素皮膚測試(tuberculin skin test, TST)等方法，雖然這些方法可行，但在檢測診斷的速度和精準度上均有所欠缺。因此開發新的生物標志物用于結核病的快速、精準診斷是十分必要的。由于外泌體諸多方面的優點，越來越多的報道開始把外泌體及其內含物當作一些難以直接檢測的細胞或器官的疾病生物標志物[31]。

3.1 外泌體miRNA可作為生物標志物

2000年Beatty等[32]發現外泌體中含有病原體衍生的抗原，被感染細胞釋放的外泌體攜帶多種可以作為特定感染因子的病原衍生分子[33]，例證了外泌體在傳染病診斷中的潛在應用價值?；诂F有證據，各種類型的細胞產生的外泌體在調節呼吸系統穩態中發揮重要作用，在各種肺部疾病的發病機制中也扮演了重要角色[34]。因此，外泌體在結核病診斷研究中越來越受到關注，在早期診斷和預防中有著極為廣闊的應用前景。首先，miRNA可以作為潛在的生物標志物用于結核病的快速診斷。研究發現，外泌體中的miRNA譜與其供體細胞炎癥狀態有關[35-36]。Mortaz等[8]研究發現，BCG感染人單核細胞源性巨噬細胞(MDMs)后，導致許多miRNA的釋放，所有這些miRNA都被預測為重要的免疫相關靶向基因。Lin等[37]通過高通量測序檢測了肺炎、肺結核和肺癌患者胸腔積液中miRNA表達模式，并從肺炎和肺結核患者胸腔積液中檢測到了3個差異表達的miRNA，從肺炎和肺癌患者胸腔積液中檢測到27個差異表達的miRNA，其中miR-378i僅在肺結核患者胸腔積液中有顯著變化。當然，目前多數研究只是在現有研究結果的基礎上推測外泌體中的miRNA有作為生物標志物用于診斷結核病的潛能，但目前并無相關miRNA作為生物標志物用于結核病的快速診斷中[25, 37-39]，因此，這方面的研究仍需深入開展。

3.2 外泌體蛋白可作為生物標志物

除了miRNA，在結核病快速診斷分子標志物的篩選中，Mtb抗原蛋白或者多肽片段也是重要的候選生物標志物。Mtb是典型的胞內寄生菌，從外泌體中尋找其分子標記具有重要意義。已有大量的研究證實，Mtb或牛分枝桿菌感染宿主細胞后釋放的外泌體含有病原體衍生抗原[22, 40]，而且其中不乏免疫原性很強的諸如ESAT6(Rv3875)、Ag85復合物(Rv3804c、Rv1886c和Rv0129c)、MPT64(1980c)和MPT63(1926c)等抗原[17, 22]。也有研究從結核病患者血清中分離出的外泌體中鑒定出了多種結核菌蛋白，包括Ag85B、BfrB、GlcB和Mpt64等[40]。Mehaffy等[41]也從結核病患者血清中分離的外泌體中檢測到了41個Mtb多肽分子，并證實其中的Cfp2、Mpt32、Mpt64 和BfrB在活動性結核病患者血清中的含量很高。Kruh-Garcia等[40]用MRM-MS技術從活動性結核病人和潛伏期結核病人血清外泌體中也檢測到了大量的源于Ag85B、Ag85C、Apa、BfrB、GlcB、HspX、KatG和Mpt64的多肽片段。此外，還可以根據血清中的外來標志物(如MPT64)區分肺內和肺外結核，并識別活動性和潛伏性疾病。這種檢測潛在感染性疾病的能力是十分重要的，這在一定程度上可以降低傳染病的傳播風險。這些研究表明外泌體中的蛋白成分也可以作為生物標志物用于診斷結核病。

目前，外泌體在結核病診斷中的應用研究方面已經取得了實質性的進展。Diaz等[42]發現Mtb感染可導致外泌體蛋白質組成的顯著變化，他們使用新的生物素標記策略對這些蛋白質在外泌體膜中進行定位，結果表明，Mtb可能影響宿主細胞的變化，這可能被用作結核病生物標志物用于檢測結核病。另外，研究發現，體液中外泌體的數量和含量可能隨疾病而顯著變化，循環外泌體的數量增加可能與肺部的疾病進展相關[43]。Schorey和Dobos[44]建立了一種快速檢測Mtb蛋白質以鑒定活動性結核病患者的方法，這項研究為外泌體在診斷結核病的應用作出了進一步的貢獻。

基于以上的研究我們不難發現，外泌體在結核病診斷中是一種具有很高潛在應用價值的分子標志物。雖然目前外泌體與結核病之間的具體關系并未研究透徹，但是不難想象，在不久的將來，將會不斷有新的分子標志物被發現。需要指出的是，目前也沒有直接的證據來證明這些蛋白或多肽可以作為生物標志物用于結核病的快速診斷中。

4 外泌體在結核病疫苗開發中的應用

目前，BCG仍然是預防結核病的唯一商業化疫苗。雖然在全球范圍內正在開發的結核病疫苗很多，也有一部分已經進入了臨床試驗階段，但這些疫苗還無法滿足臨床理想的要求。外泌體是許多生理過程的重要調節因子，包括組織體內平衡、免疫刺激或免疫抑制等。從抗原提呈細胞釋放的外泌體包含MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和CD86，并且可以刺激機體產生有效的免疫應答[45-46]。研究發現，來源于樹突狀細胞的外泌體可以誘導非常強的免疫應答[47]。含有HSP70的外泌體可以通過激活自然殺傷細胞(NKs)和巨噬細胞來達到促炎的效果[48]。Koyama等[49]用編碼Mtb抗原早期分泌抗原靶標-6(6-kDa early secretory antigenic target, ESAT-6)的質粒轉染B16黑素瘤細胞并收集其分泌的外泌體，當該外泌體被注射到小鼠體內時，可以顯著誘發針對ESAT-6的細胞免疫應答，說明含有Mtb抗原(或其表位)的外泌體具有作為結核病疫苗的潛力，這為結核病疫苗的研究開發提供了一條新思路。還有研究發現Mtb培養物濾液蛋白(culture filtrate protein, CFP)處理后的巨噬細胞釋放的外泌體能夠激活機體的先天性和獲得性免疫應答，由于不需要用活毒菌株進行處理，這種CFP處理巨噬細胞產生的外泌體很容易制備[21, 50]，可能是很好的疫苗材料。值得一提的是，Cheng和Schorey[50]觀察到含有泛素化標簽重組抗原的外泌體可有效地引發T細胞應答。另外，Smith等[51]發現，泛素化作用在Mtb抗原從細胞進入外泌體的過程中發揮重要作用。這表明基于泛素化的外泌體蛋白遞送策略可以為防治肺結核病提供一種獨特的方法來產生具有潛力的新型疫苗。

目前，外泌體與抗Mtb疫苗領域的研究不斷有新的發現。雖然外泌體作為結核病疫苗仍存在一些問題，比如外泌體引起特異性免疫的抗原還未全面了解；外泌體攜帶的各種抗原在機體免疫中的具體機制尚不明確等，但是整體來說外泌體仍是結核病治療策略分析設計的理想資源。它們易于純化，并富含分枝桿菌的多種產物，比如蛋白質、分枝桿菌脂質和RNA等[52-54]。它們在感染期間的持續性和炎癥過程中變化，都可以為疫苗的開發提供思路。我們有理由相信外泌體能夠成為一種新型抗結核病疫苗并得到廣泛的應用。

5 結論及展望

外泌體的發現對人類認識機體生理、病理的方式產生了重要影響，有很多生物醫學相關的生化和分子生物學的研究在外泌體分析的層面上都可以開拓一個新的思路。Mtb感染宿主細胞后，宿主細胞分泌的外泌體中含有多種Mtb抗原成分，這些抗原可以有效地激發宿主產生先天性免疫和獲得性免疫應答，從這個意義上說，外泌體是抗結核疫苗有效的載體。在結核病發生發展過程中，外泌體可以作為載體向免疫細胞提呈抗原，也能有效地激活諸如巨噬細胞、T細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞，當然也能抑制部分免疫細胞的功能，起到復雜的免疫調控作用。目前結核病的免疫機制，尤其是結核病病原菌逃避宿主細胞免疫監視和清除的機制研究尚未有重大的理論突破。因此深入研究外泌體對免疫細胞的復雜調控機制，將有助于闡明宿主抗結核免疫的分子機制以及Mtb逃逸宿主殺傷的免疫逃逸機制，對結核病的快速診斷、新型抗結核病藥物和疫苗的開發等具有一定的理論和現實意義。希望不久的將來，關于外泌體在結核病領域的研究能幫助人們在結核病研究中取得重大的突破。