羊布魯菌體內誘導基因的篩選與初步鑒定

楊艷玲，程悅寧，張 萍，周玉成，張海威，程世鵬*

(1.中國農業科學院特產研究所特種經濟動物分子生物學重點實驗室，長春 130122；2.吉林農業大學，長春 130118)

布魯菌病(Brucellosis，簡稱布病)是由布魯菌(Brucella)引起的人畜共患傳染病，造成多種動物和人感染，危害日益加重[1]。當前布病的防控主要是采取血清監測和疫苗免疫為主的措施，現有的弱毒疫苗免疫由于存在安全隱患以及目前的檢測方法的靈敏性和特異性等問題嚴重阻礙了人畜布魯菌病的凈化和防控工作。為此，篩選和鑒定有效的毒力因子、疫苗候選抗原和診斷標識對于研制安全有效的疫苗和建立靈敏特異的診斷方法具有重要的意義。“體內誘導表達抗原技術”(invivo-induced antigen technology, IVIAT)被廣泛用于一些病原菌毒力分子和候選抗原篩選鑒定的研究中，“體內誘導基因”是致病菌在宿主體內表達而在體外不表達的功能基因[2-4]。大量研究證實，這些僅體內表達的基因常常對病原菌在體內的致病和生存有重要意義。通過收集病原菌在不同感染途徑，不同感染階段的康復血清可以獲得病原菌在不同感染階段可能產生的不同抗原物質，這些抗原物質有的是病原菌重要的毒力成分，有的是病原菌診斷標識以及藥物靶點，對研究病原菌的致病、疫苗和診斷具有重要意義。為此，本研究構建了羊布魯菌基因表達文庫，收集臨床上羊布魯菌感染陽性血清，利用IVIAT篩選鑒定羊布魯菌特異的體內誘導抗原。對篩選得到的基因進行RT-PCR驗證，為篩選和鑒定布魯菌新的毒力分子、診斷靶標、疫苗候選抗原和藥物靶點提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和培養基 布魯菌16M標準菌株為軍事醫學院軍事獸醫研究所王興龍研究員惠贈；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)購自TaKaRa生物；質粒pET-30abc(+)購自Thermo Scientific,TSB培養基購自Sigma，用于培養布魯菌16M菌株；LB培養基(OXOID)用于培養大腸桿菌；卡那霉素(購自Merk)終質量濃度為50 μg·mL-1。所有菌株均用20%甘油保存于-70 ℃冰箱中；試驗用血清采自感染羊布魯菌的羊，虎紅平板凝集試驗檢測為陽性。

1.1.2 主要試劑 DNA限制性內切酶、TaqDNA聚合酶、CIAP、DNA連接試劑盒、細菌DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、膠回收及質粒提取試劑盒均購自TaKaRa公司。氯霉素、X-gal、IPTG等購自上海生物工程有限公司。混合蛋白酶抑制劑購自ROCH公司，辣根過氧化物酶標記的兔抗鹿IgG購自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 文庫構建 布魯菌16M標準菌株在TSB培養基中37 ℃培養48 h，然后提取基因組DNA，用限制性內切酶Sau3AⅠ 37 ℃酶切2 h。然后回收大小在0.5～2 kb的片段，用T4連接酶連接到pET-30abc(先用BamHⅠ酶切載體，然后再用CIAP去磷酸化)載體中，4 ℃過夜。將基因組連接產物轉化至大腸桿菌DH5α 感受態細胞中，涂布于含卡那霉素(50 μg·mL-1)的LB平板上，37 ℃過夜培養，隨機挑取100個單菌落在LB液體培養基中37 ℃過夜培養，分別提取質粒，用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定構建的文庫是否合格(空質粒少于20%)，將平皿上的菌落用PBS全部洗下，提取質粒即為構建好的布魯菌基因組文庫。將基因組文庫質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中進行表達。

1.2.2 血清探針的制備 從布魯菌感染梅花鹿的陽性血清中隨機選取7份混合在一起(陽性血清來自于吉林省動物疫病防控中心)，這些血清樣本分別用虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗和ELISA進行檢測，均確定為布魯菌陽性血清。將血清用0.22 μm 的濾膜過濾，用膜吸附法先與布魯菌16M全菌進行作用，37 ℃ 30 min，去除布魯菌菌體表面蛋白的抗體，吸附過程重復3～5次，用ELISA檢測抗體下降的程度，然后再將上述血清分別與布魯菌菌體裂解產物和大腸桿菌BL21的裂解產物進行吸附，分別去除布魯菌裂解產物的抗體及宿主菌的抗體。吸附后所得血清即為制備的布魯菌血清探針。

1.2.3 表達文庫的免疫篩選 將轉化獲得的表達文庫菌液以適宜濃度涂布于含有卡那霉素(50 μg·mL-1)的LB平板上，37 ℃培養5 h，將滅菌的PVDF膜小心放入長好的平板上，充分接觸復印15 min，做好標記，將標記好的PVDF膜放入含卡那霉素(50 μg·mL-1)和IPTG(1 mmol·L-1)的LB平板上，菌落面朝上，37 ℃培養4 h，取出PVDF膜，在氯仿蒸汽中熏蒸15 min，部分裂解菌落。立即加入10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用PBS-T (含0.5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液)洗滌5 min后，加入PBS稀釋(1∶200)的吸附后血清4 ℃過夜孵育，PBS-T洗滌，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗鹿IgG(1∶20 000)，室溫孵育1 h，PBS-T洗滌，TMB顯色，將結果與母板對比，標記出陽性菌落。挑取陽性菌落劃線于含卡那霉素(50 μg·mL-1)的LB平板上，37 ℃過夜培養，挑取陽性菌落于含卡那霉素(50 μg·mL-1)LB液體培養基中37 ℃過夜培養，20%甘油保存于-70 ℃冰箱中。

1.2.4 基因鑒定 以僅含有pET-30a/b/c空載體的大腸桿菌BL21(DE3)為陰性對照，剔除假陽性克隆，對上一步確定的陽性克隆再次進行菌落免疫印跡篩選，步驟相同，篩選出與對照比較仍呈陽性反應的克隆。提取最終確定的陽性克隆的質粒，對插入序列進行基因測序鑒定。測序結果在NCBI entrez database′sB.melitensis和B.abortusgenomes數據庫中進行檢索，用PSORTb 2.0 軟件進行細胞定位。

1.2.5 RT-PCR驗證 提取培養48 h的布魯菌16M總RNA，用DNaseⅠ消化RNA中的基因組DNA，用核酸定量儀檢測RNA的純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，-80 ℃凍存備用。參照PrimeScriptTMRT-PCR Kit使用說明書進行RNA逆轉錄，根據上述IVIAT鑒定的陽性產物測序結果所得序列設計引物(表1)，按照RT-PCR試劑盒的反應體系，優化反應條件進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠檢測擴增結果。

表114個體內誘導表達基因的PCR引物

Table1FourteenPCRprimersthatinducedexpressionofthegeneinvivo

編號No.基因名稱Gene引物(5'→ 3') Primer1glucose-6-phosphate dehydrogenaseF-TCGGCCTGATCCACCTCTTCR-ATCCCTTCGACTGCATCGTTTT2Copper-binding periplasmic protein precursorF -CGTGAAATGAATGCCGATGCR-ATAGAACGCTGGCTGGAGGC3NAD(P)H quinone oxidoreductaseF-TTTCCTTCGATCCTGCGGTGGTR-TTGGCTGGCGGTGGCTATGC4tRNA uridine 5-carboxymethylaminomethyl modification enzyme GidAF-TTGAAATGTGGTGCCGTGGTTR-GCGATCCGTCATAAGCGAGAA5cyclic nucleotide-binding domain proteinF-TTGCGGTCGGAATAGAGGAACR-CGAAACCCGTGGAAGTGGATG6aldehyde dehydrogenase family proteinF-GCGCAGTGCCATGTCCAGATR-AGCCCGAAAGTTCCCGTTGT7betaine-aldehyde dehydrogenaseF-GTCAGGATGCGATTGAGAAGGGR-CCGAGGCAACAGCAACCACT8hypothetical protein DUF1332R-TGAACCAGAACAACCCTTCCCF-GTTTGATCGTCTGCTGGAATT9cobalamin synthesis protein P47KF-GCCTGTTTGACGGCTTCCTCR-CATCCTCTTCTCACGCAGGTTT10acetate-CoA ligaseF-TGCGAGACAAGTGCCGATTCR-CAATGTGCAGGAGGGCGTAG11cobW/HypB/UreG, nucleotide-binding domain proteinF-ATATGCTTTGGGCGTTGATGR-TTGGCGATGCGAAAATTAGA

(轉下頁 Carried forward)

2 結 果

2.1 表達文庫的構建

提取羊布魯菌16M基因組，如圖1所示。用16倍倍比稀釋的Sau3AⅠ酶切基因組，基因組片段大小均在0.5～2 kb之間，如圖2所示。酶切片段純化后與線性去磷酸化的表達載體pET-30a/b/c連接，轉化到DH5α中，構建羊布魯菌16M基因組文庫，大小為4×104。將構建好的重組質粒文庫全部轉入BL21感受態細胞中，隨機抽取轉化子，利用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切的方法，檢測插入效率，插入效率約為90%，空質粒低于20%，證明構建的文庫合格，如圖3所示。

2.2 羊布魯菌體內誘導抗原的篩選與鑒定

利用臨床上采集的7份羊布魯菌陽性血清經過充分吸附后制成的免疫探針，篩選陽性克隆，菌落能夠與血清探針進行特異性反應，結果有14個特異性菌落發生了特異性反應。如圖4A所示。對這14個特異性插入序列進行測序，測序結果在NCBI GenBank上B.melitensis和B.abortus基因組序列中進行檢索，14個產物均屬于B.melitesis和B.abortus兩株布魯菌的基因產物，它們分別是：glucose-6-pho-

M.DNA相對分子質量標準；泳道1～4均為布魯菌16M基因組M. DNA marker; Lanes 1-4 are Brucella 16M genomes圖1 羊布魯菌16M基因組電泳圖Fig.1 Electrophoresis map of Brucella 16M genome

M.DNA相對分子質量標準；泳道1～5分別為內切酶稀釋4、8、16、32、64倍的酶切結果M. DNA marker; Lanes 1-5 were the results of digestion by endonuclease diluted 4, 8, 16, 32 and 64 times圖2 布魯菌16M基因組Sau3AⅠ部分酶切Fig.2 Brucella 16M genome partially digested by Sau3AⅠ

M.DNA相對分子質量標準；泳道1～10為用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定挑取的10個轉化菌M. DNA marker; Lanes 1-10 were double-digested with KpnⅠ and HindⅢ to identify the 10 transformed bacteria圖3 雙酶切鑒定電泳圖Fig.3 Double enzyme digestion identification by electrophoresis

sphate dehydrogenase(葡萄糖-6磷酸脫氫酶)； copper-binding periplasmic protein precursor(周質銅結合蛋白前體)；NAD(P)H quinone oxidoreductase, PIG3 family protein [NAD(P)H醌氧化還原酶PIG3家族蛋白]； tRNA uridine 5-carboxy methylaminomethyl modification enzyme GidA(mnmG) (tRNA尿苷5-羧基甲基氨甲基修飾酶GidA)； cyclic nucleotide-binding domain protein(環核苷酸結合域蛋白)；aldehyde dehydrogenase family protein(乙醛脫氫酶家族蛋白)；betaine-aldehyde dehydrogenase(三甲基甘氨醛脫氫酶)；hypothetical protein DK61_1527(未知蛋白)；cobalamin synthesis protein P47K(鈷氨素合成蛋白P47K)；acetate-CoA ligase(乙酸CoA連接酶)；cobW/HypB/UreG, nucleotide-binding domain protein(核苷酸結合域蛋白)； tellurite resistance TerB family protein(亞碲酸抑制TerB家族蛋白)；nitrous oxide reductase maturation NosD family protein(一氧化二氮成熟體NosD家族蛋白)； propionate-CoA ligase(丙酸CoA連接酶)。通過PSORTb 2.0軟件分析，這些蛋白主要與布魯菌的糖代謝、RNA修飾、離子轉運和跨膜運輸等功能相關，分別位于布魯菌細胞質和細胞膜內(詳見表2)。

2.3 IVIAT鑒定基因產物RT-PCR分析

根據獲得的14個體內誘導基因設計特異性引物，對布魯菌16M反轉錄得到的cDNA進行RT-PCR擴增，RT-PCR結果顯示有14個基因得到了特異性擴增，驗證了這些基因均屬于布魯菌基因組基因。結果如圖4B所示。

1. 葡萄糖6-磷酸脫氫酶；2. 銅離子結合周質蛋白前體；3. NAD(P)H醌氧化還原酶，PIG3家族蛋白；4. tRNA尿苷5-羧基甲氨基甲基修飾酶GidA(mnmG)；5. 環核苷酸結合域蛋白；6. 乙醛脫氫酶家族蛋白；7. 三甲基甘氨醛脫氫酶；8. 假定蛋白DK61_1527；9.鈷氨素合成蛋白p47K；10. 乙酸輔酶A連接酶；11. cobW/HypB/UreG核苷酸結合域蛋白；12. 亞碲酸抑制TerB家族蛋白；13. 一氧化二氮還原酶NosD家族蛋白；14 丙酸輔酶A連接酶；M.核酸相對分子質量標準1. Glucose-6-phosphate dehydrogenase；2. Copper-binding periplasmic protein precursor；3. NAD(P)H quinone oxidoreductase, PIG3 family protein；4. tRNA uridine 5-carboxy methylaminomethyl modification enzyme GidA(mnmG)；5. Cyclic nucleotide-binding domain protein；6. Aldehyde dehydrogenase family protein；7. Betaine-aldehyde dehydrogenase；8. Hypothetical protein DK61_1527；9. Cobalamin synthesis protein P47K；10. Acetate-CoA ligase；11. CobW/HypB/UreG, nucleotide-binding domain protein；12. Tellurite resistance TerB family protein；13. Nitrous oxide reductase maturation NosD family protein；14. Propionate-CoA ligase；M. DNA marker圖4 IVIAT篩選抗原與陰性對照血清的菌落免疫印跡反應(A)及陽性克隆RT-PCR驗證(B)Fig.4 Colony-immunoblotting of IVIAT screening antigens with negative control sera(A) and positive clones RT-PCR verification electrophoresis(B)

3 討 論

體內誘導抗原鑒定技術(IVIAT)是一種新型的鑒定病原微生物體內表達基因的方法，該方法是利用感染并康復的動物血清，用體外培養的病菌全細胞、細胞裂解液及熱變性細胞裂解液吸附處理收集的動物血清，再用吸附后的血清為探針來篩選已構建于大腸桿菌宿主菌的病菌基因組表達文庫，陽性反應克隆則含有病菌DNA序列所編碼的體內抗原。大量的研究表明，這些獨特的在體內表達而在體外不表達的基因往往對病原菌在體內的生存和致病有重要意義，這些基因多半是病原菌的毒力因子、免疫候選抗原、藥物靶點和分子診斷標識。因此，近年來有關病原菌的體內誘導基因的研究越來越受到重視。該方法不需要動物模型，無需直接對病原微生物進行操作，可以檢測瞬時表達以及不同感染途徑、不同感染階段的基因等優點，因此在較為復雜以及具有毒性的病原微生物中有著廣泛的應用前景[5-7]。

表2NCBI比對鑒定得到的蛋白信息表

Table2NCBIidentificationoftheresultingproteininformationtable

編號No.布魯菌基因產物IDBrucella menlitensisgene product IDCOG或CDDCOG or CDD功能預測Putative function細胞定位預測Predicted cellullar localization1WP_006121516Glucose-6-phosphate dehydrogenase氧化還原酶活性,參與葡萄糖代謝過程cytoplasm2PRJNA227977Copper-binding periplasmic protein precursor銅離子轉運過程membrane3AIJ90407.1NAD(P)H quinone oxidoreductase, PIG3 family proteinNADH脫氫酶活性,幫助醌結合cytoplasm4PRJNA244262tRNA uridine 5-carboxy methylaminomethyl modification enzyme GidA(mnmG)參與tRNA尿苷轉錄修飾cytoplasm5WP_002965067.1Cyclic nucleotide-binding domain protein參與細胞內部多種物質代謝過程cytoplasm6AE017224.1Aldehyde dehydrogenase family protein參與乙醛代謝過程plasma membrane7BAB_RS31655Betaine-aldehyde dehydrogenase參與甘氨酸三甲胺乙內酯的合成cytoplasm8BAB_RS28320Hypothetical protein DK61_1527未知功能plasma membrane9PRJNA33767Cobalamin synthesis protein/ P47K family protein參與鈷氨素的生物合成過程plasma membrane10PRJNA243901Acetate-CoA ligase參與乙酰輔酶A的生物合成cytoplasm11AIJ94334.1CobW/HypB/UreG, nucleotide-binding domain protein氮化合物代謝過程cytoplasm12PRJNA243878Tellurite resistance TerB family protein功能未知membrane13PRJNA243893Nitrous oxide reductase maturation NosD family protein膜的有機成分組成membrane14CAP05266.1Propionate-CoA ligase參與丙酸破壞過程和二檸檬酸甲酯循環cytoplasm

本研究利用IVIAT技術，從大概40 000個含有布魯菌16M基因組片段的大腸桿菌克隆中篩選得到了14個體內誘導表達基因。經RT-PCR驗證，這些基因均是布魯菌16M體內誘導表達的基因。它們主要是布魯菌糖代謝，離子物質運輸，細胞膜組成以及RNA修飾等過程中重要的基因表達產物。在先前的研究中利用IVIAT方法也鑒定了一些布魯菌體內誘導表達的基因， Lowry等[8]運用麋鹿血清從B.abortusRB51的基因組表達文庫中成功篩選得到了10個布魯菌體內誘導基因，驗證了MDH、AfuA、D15等基因。孫曉慶[9]運用牛血清從牛布魯菌疫苗株A19基因組中成功篩選得到33個體內誘導表達基因，并對Fumly、SDR、MDH、Nirase、Fumhy、EnvZ、AfuA和D15等8個體內誘導抗原進行原核表達和免疫原性分析。然而在本試驗中，利用IVIAT篩選到的14個體內誘導表達基因與他們的研究獲得的體內誘導基因完全不一致，這些基因全部是未曾被報道過的基因，這主要有二個原因，其一是采用的宿主血清和布魯菌菌株不同，本研究的研究對象是羊的血清和平滑型菌株羊布魯菌16M，而其他學者開展研究所使用的血清分別是牛、麋鹿等動物血清，菌株分別是粗糙型牛布魯菌疫苗株RB51[8]和平滑型牛布魯菌疫苗株A19[9]。布魯菌的種型之間，疫苗株和強毒株之間，平滑型菌株和粗糙型菌株之間在致病和免疫過程中誘導產生的基因存在較大差異，這就是本試驗所得到的誘導基因與其他研究不一致的根本原因。其二是細菌培養時間不同，在本研究中細菌培養時間為48 h，而其他研究中細菌培養時間為24 h，這也是導致所得到的誘導抗原不一致的主要原因之一。細菌在不同培養時間所誘導表達的基因也存在著較大的差異。因此，在我們的研究中可以真實客觀地反映出羊布魯菌強毒株感染過程中所誘導表達的重要基因，這些基因對于研究羊布魯菌建立感染、識別免疫、參與細胞代謝起到了至關重要的作用。在鑒定的14個基因中，有的已經被驗證了在布魯菌中的作用，如環核苷酸結合蛋白(cyclic nucleotide-binding domain protein，CNB)已經被研究發現是布魯菌潛在的藥物靶點， CNB是環核苷單磷酸(cyclic nucleotide monophosphate，cNMP) 結合蛋白的保守區，cNMP結合蛋白根據其在細胞內的功能已經被認為是潛在的藥物作用靶點。CNB是關鍵的細胞裝置組成部分，調節多個細胞內部過程。這些蛋白結構域已經在幾個蛋白家族被發現，如cAMP受體蛋白(CRP), cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶(PKA和PKG)以及ether-a-go-go(EAG)通道蛋白。CNB主要負責兩個二級信使cAMP和cGMP的結合[10]。本研究中通過體內誘導抗原技術也鑒定到了該基因，這為研究布魯菌治療藥物的篩選提供了科學依據。

tRNA尿苷 5-羧基甲基氨甲基修飾酶GidA [tRNA uridine 5-carboxy methylaminomethyl modification enzyme GidA(mnmG)]是tRNA修飾過程中十分重要的酶，在真核生物和原核生物的翻譯過程中，tRNA修飾酶GidA有助于tRNA的正確折疊和結構穩定以及在監督密碼子和反密碼子正確翻譯中起到了重要作用[11]。在幾個致病病原菌中，GidA在細菌生長、細胞分裂以及毒力調節等過程中均起到了關鍵的作用。在Ⅱ型鏈球菌中發現該基因不僅影響了細菌生長、細胞分裂、莢膜合成，也嚴重影響了Ⅱ型鏈球菌的毒力[12]。然而該基因在布魯菌中的作用還沒有被報道，有可能成為布魯菌新的毒力分子。

亞碲酸鹽抗性TerB家族蛋白(tellurite resistance TerB family protein)是細菌重要的毒力因子，在吞噬體抑制、毒素耐受以及細菌毒力等方面發揮著重要的作用。在很多細菌都有該基因，如大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等，幫助細菌在吞噬細胞內生存和復制[13]。本研究首次在布魯菌中發現該基因，該分子也有可能成為布魯菌在細胞內生存的重要毒力分子。

本研究中也篩選到NosD家族蛋白(nitrous oxide reductase maturation NosD family protein)。NosD是屬于糖水化合物和糖水解域的蛋白，其具體生物學意義還不是很清楚[14]。NosY是六螺旋的轉膜蛋白，其被認為是和NosF和NosD一起形成ABC轉運體，有研究已經表明ABC轉運體是布魯菌與宿主相互作用過程中的重要毒力因子，具有致病作用，也是重要的免疫成分，可用于布魯菌疫苗候選抗原[15]。在我們的研究中鑒定得到的NosD有可能成為布魯菌重要的免疫識別抗原。

NAD(P)H醌氧化還原酶PIG3家族蛋白[NAD(P)H quinone oxidoreductase, PIG3 family protein]主要參與腫瘤凋亡，被用作長期的腫瘤促凋亡的標識[16]，然而在本研究中鑒定得到了該蛋白，該分子也可能與布魯菌細胞內生存有關，也可作為布魯菌感染宿主細胞后細胞凋亡的診斷標識，布魯菌可能通過抑制該基因的表達來抑制宿主細胞的凋亡，從而在宿主內得以生存。

雖然本研究所鑒定的14個布魯菌體內誘導基因中有些基因的功能還未知，但是從上述已知的基因功能中我們不難發現這些基因在布魯菌的胞內生存、毒力作用、細胞代謝、免疫識別等重要生物學過程中起著關鍵作用，有可能成為布魯菌新的毒力分子，藥物作用靶點和免疫識別標識，有待我們進一步通過試驗研究來證實這些基因的重要功能，本研究結果對于研究布魯菌的致病機制，篩選藥物作用靶點和分子診斷標識提供了科學依據。

4 結 論

本研究將體內誘導抗原技術(IVIAT)成功地應用到布魯菌候選抗原和診斷標識的篩選和鑒定研究中，利用該技術成功獲得14個體內誘導基因，這些基因在布魯菌的毒力和免疫中均具有重要意義，將為布魯菌疫苗的研制和診斷產品的研發提供候選抗原和診斷標識。