兩株小鼠致病性差異顯著的H5N1禽流感病毒PA蛋白差異互作宿主蛋白研究

高 照，胡 嬌，劉秀梵*

(1.揚州大學獸醫學院動物傳染病實驗室，揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009)

禽流感病毒(AIV)是一種能夠導致急性呼吸系統疾病的病原體，它不但能夠感染禽類，給養禽業帶來巨大經濟損失；還能夠跨種傳播感染并致死哺乳動物(包括人類)，給公共衛生帶來極大威脅[1]。AIV是一種有包膜結構的負鏈RNA病毒，其基因組包含8個RNA片段編碼至少17種病毒蛋白，包括10種最初鑒定的蛋白質(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、NS2)和7種新發現的病毒蛋白PB1-F2、PB1-N40、PA-X、PA-N155、PA-N182、M42和NS3。PA蛋白是病毒RNA聚合酶復合物的第三個亞基，它在AIV的生命周期和發病機制中具有多重作用。PA蛋白的N-末端具有核酸內切酶活性、帽結合和啟動子結合的能力，從而影響病毒轉錄和復制[2]； PA蛋白的位點突變有助于AIV跨越宿主屏障、增強AIV的宿主適應性[3-4]；此外，PA的關鍵位點能影響病毒的毒力[5-6]；并且PA蛋白與宿主蛋白的“shut-off”有關[7-8]。然而PA蛋白在AIV生命周期和發病機制中發揮其作用的潛在機制在很大程度上仍是未知的。

流感病毒自身并不具有復制能力，感染宿主后必須借助宿主細胞系統進行復制。許多研究已經證實流感病毒依賴于宿主細胞蛋白來維持其生命周期和致病性[9-11]，而蛋白之間的相互作用是維持宿主和病毒之間聯系的關鍵方式，并且目前已經鑒定出能與流感病毒PA蛋白相互作用的宿主因子。HAX1是一種具有抗凋亡功能的細胞質蛋白，它能夠與PA的核定位信號域結合，在病毒感染的細胞中，HAX1可以阻止PA的核積累來抑制病毒復制，這表明HAX1-PA相互作用是宿主用來限制病毒感染的防御機制之一[12]。hCLE是與PA蛋白相互作用的另一個宿主因子，PA的兩個區域(氨基酸殘基493—512和557—574)被證實與hCLE相互作用[13]，在流感病毒感染期間，hCLE-PA相互作用能夠增加病毒聚合酶活性，促進病毒RNA轉錄和復制，提高病毒滴度和病毒顆粒產生[14]。PA也與MCM復合體有相互作用，MCM復合體是病毒基因組復制的宿主調節劑[15]。此外，RanBP5[16]、AIFMI[17]、NPM[18]和RIG-I[19]等也被發現與PA相互作用并影響AIV的生命周期。然而，考慮到PA蛋白在流感病毒生命周期中的多重效應，其他與PA蛋白相互作用的宿主因子仍需要被鑒定。

目前，雖然在禽流感病毒基因變異、蛋白結構和功能等研究方面有了顯著進展，但從病毒-宿主蛋白質互作的角度解析禽流感病毒的致病機制及宿主拮抗流感病毒感染的機制研究依然較少。以禽流感病毒-宿主蛋白的相互作用為突破口，是解析禽流感病毒致病機制和宿主拮抗病毒感染機制的另一思路。本研究通過篩選與致病性差異的H5N1 AIV有相互作用的人類細胞蛋白，可能從宿主方面闡釋H5N1 AIV PA蛋白調控病毒生命周期及致病能力方面提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 毒株與細胞

本研究所用的主要由PA基因決定的致病性差異的一對模式病毒為本實驗室分離保存，分別為對小鼠表現為高致病性的CK10病毒: A/Chicken/Jiangsu/k0402/2010(小鼠半數致死劑量為0.33 log10EID50)和對小鼠表現為低致病性的GS10病毒：A/Goose/Jiangsu/k0403/2010(小鼠半數致死劑量> 6.32 log10EID50)[20]。A549細胞購自中國科學院上海細胞研究所。

1.2 免疫沉淀(IP)

提取細胞蛋白：將細胞上清棄去后，用預冷的PBS洗兩遍，然后將殘留PBS吸干，加入600 μL含濃度1 mmol·L-1PMSF的RIPA細胞裂解液(碧云天)，冰上裂解，并用搖床輕輕搖晃20 min，使細胞徹底裂解，收集于指形管中，然后在4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min，取上清備用。

蛋白質與抗體結合：在獲得的細胞蛋白質中加入總量為5 μL的PA兔多克隆抗體(GeneTex)，對照組則加入總量為5 μL的非特異性兔多克隆抗體(GeneTex)，試驗組與對照組各三個重復，然后在4 ℃搖床輕搖過夜。

抗體與agarose結合：取30 μL Protein A+G agarose(Sigma)分別加入對照組與試驗組的蛋白質與抗體混合物中，4 ℃搖床輕搖5 h。

洗脫：將充分作用后的樣品以12 000 r·min-1瞬離，棄掉上清，加入預冷的PBS，輕輕顛倒混勻，12 000 r·min-1瞬離，棄上清，如此重復操作5次，最后用Glycline-HCl(pH = 3.0)洗脫，進行質譜分析。

1.3 質譜分析(LC-MS/MS)

溶液內酶解：吸取已制備好的樣品(約30 μg)，加入30 μL STD buffer，沸水浴5 min，冷卻至室溫。加入200 μL UA buffer(8 mol·L-1Urea，150 mmol·L-1Tris-HCl pH8.5)混勻，轉入30 kDa超濾管離心。加入200 μL UA buffer離心，棄濾液。加入100 μL IAA(50 mmol·L-1IAA in UA)，振蕩1 min，避光室溫孵育30 min，離心。加入100 μL UA buffer，離心，重復2次。加入100 μL 25 mmol·L-1NH4HCO3，離心，重復2次。加入40 μL 25 mmol·L-1NH4HCO3同時加入Trypsin，酶切過夜后離心。再加入40 μL 25 nmol·L-1NH4HCO3，離心，酸化。

毛細管高效液相色譜方法：A液為0.1%甲酸的水溶液，B液為0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈為84%)。色譜柱以95%的A液平衡后，樣品由自動進樣器上樣至Trap柱。色譜梯度：0～50 min，A液線性梯度從4% 到50%；50～54 min，B液線性梯度從50%到100%；54～60 min，B液維持在100%。

質譜數據采集：多肽和多肽碎片的質量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描(full scan)后采集10個碎片圖譜(MS2 scan)。

數據分析：質譜測試原始文件(raw file)用Mascot2.2軟件檢索相應的數據庫，最后得到鑒定的蛋白質結果。數據庫搜索參數如下，Database: uniprot Taxonomy，Human(145758)；Enzyme: Trypsin； Dynamical modifications: Oxidation (M)； Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)；Max Missed Cleavages: 2；ProteomicsTools: 3.1.6；Filter by score ≥20。

1.4 生物信息學分析軟件

GO注釋使用Database for Annotation Visualization and Integrated Discovery (DAVID) (版本 6.7)；細胞通路分析使用KEGG通路數據庫分析。

1.5 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)

以1個MOI劑量的CK10和GS10病毒分別感染A549細胞，PBS感染作為對照。36 h后收集細胞蛋白，每個組分別使用PA與eEF1A1抗體進行IP試驗，所得免疫復合物用eEF1A1及PA抗體進行Western blot試驗進行分析驗證。

1.6 Western blot

樣品加入上樣緩沖液后沸水煮5 min變性，12% SDS-PAGE中電泳分離后，并將其轉印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，120 V轉印1 h。轉印完畢后，用5%脫脂奶37 ℃封閉1 h，用合適的抗體進行孵育，室溫 2 h，隨后，將膜用含0.05% Tween-20的TBST洗滌4次，每次10 min，再用合適的酶標二抗室溫孵育1 h，再次將膜用含0.05% Tween-20的TBST洗滌4次，最后用增強的化學發光(ECL)系統來檢測印跡蛋白質。

2 結 果

2.1 篩選與PA蛋白有相互作用的宿主細胞蛋白

為了有效地從AIV感染的細胞中鑒定與PA相互作用的宿主蛋白，測定了PA蛋白的峰值表達點。以1個MOI的劑量用CK10病毒感染A549細胞，在感染后12、24、36、48和60 h收獲細胞蛋白，然后用PA抗體進行Western blot分析，同時以β-actin蛋白作為對照。結果表明，在CK10病毒感染A549過程中，PA表達水平逐漸升高，在感染后36 h左右達到最高[21]。因此，收集病毒感染細胞36 h后的細胞蛋白，并用PA抗體或作為對照的無關抗體進行免疫沉淀；得到的蛋白復合物通過LC-MS / MS分析，結果顯示，與對照組相比(三個重復試驗中至少出現兩次的蛋白即視為存在相互作用)，檢測到278種與CK10病毒PA蛋白特異性沉淀的宿主細胞蛋白，287種與GS10病毒PA蛋白特異性沉淀的宿主細胞蛋白。而與GS10病毒相比，有160種宿主蛋白能夠與CK10病毒PA蛋白特異性結合(表1)。

2.2 生物信息學分析-GO (Gene Ontology)注釋

為了揭示與PA蛋白相互作用的差異宿主蛋白的功能，將所篩選的CK10與GS10 病毒PA相互作用差異的160種宿主蛋白質進行GO注釋分析。如圖1所示，GO注釋分為三個方面，包括生物學進程(biological process)、細胞組成(cellular component)和分子功能(molecular function)。生物學進程分析結果顯示：這160種宿主蛋白主要參與基因表達、翻譯、病毒感染和病毒轉錄等生物學進程(圖1A)，表明與流感病毒的感染息息相關；細胞組成分析結果顯示，與PA蛋白相互作用的宿主蛋白主要分布于細胞質(圖1B)；基于分子功能的分析結果表明，與PA相互作用的宿主蛋白主要發揮結合功能(圖1C)。

表1特異性與CK10病毒PA蛋白互作的宿主蛋白(部分蛋白)

Table1HostproteinsspecificallyinteractwithCK10PAprotein(selectedproteins)

蛋白登錄號GenBank accession number基因符號Gene symbol蛋白名稱Protein nameP68104eEF1A1Elongation factor 1-alpha 1H0Y3T0ATRXTranscriptional regulator ATRXP10914IRF1Interferon regulatory factor 1P0C869PLA2G4BCytosolic phospholipase A2 betaQ13162PRDX4Peroxiredoxin-4P24385CCND1G1/S-specific cyclin-D1Q96J66ABCC11ATP-binding cassette sub-family C member 11P67809YBX1Nuclease-sensitive element-binding protein 1O60861GAS7Growth arrest-specific protein 7Q96BF6NACC2Nucleus accumbens-associated protein 2Q86YH2ZNF280BZinc finger protein 280BQ9NW97TMEM51Transmembrane protein 51Q9UGU0TCF20Transcription factor 20B0YJC4VIMVimentinP63244GNB2L1Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-2-like 1P05141SLC25A5ADP/ATP translocase 2Q9UBN6TNFRSF10DTumor necrosis factor receptor superfamily member 10DP63261ACTG1Actin, cytoplasmic 2P42330AKR1C3Aldo-keto reductase family 1 member C3P00540MOSProto-oncogene serine/threonine-protein kinase mosP27701CD82CD82 antigenP00338LDHAL-lactate dehydrogenase A chain

2.3 生物信息學分析-KEGG通路

通過KEGG數據庫對所篩選到的與PA相互作用的差異宿主蛋白進行細胞通路分析，發現其中的57種蛋白參與了126條細胞通路。主要涵蓋了六種類型的細胞通路，包括人類疾病(human diseases)、遺傳信息處理(genetic information processing)、生物系統(organismal systems)、代謝(metabolism)、細胞過程(cellular processes)和環境信息處理(environmental information processing)(圖2A)；其主要參與的細胞通路為翻譯、傳染病、癌癥和信號轉導(圖2B)。

2.4 Co-IP驗證eEF1A1特異性地與CK10病毒PA蛋白相互作用

采用IP結合LC-MS/MS的方法，本研究篩選到eEF1A1可能特異性與CK10病毒PA存在相互作用。隨后利用Co-IP進行了進一步的驗證。分別以1個MOI劑量的CK10和GS10病毒或PBS作為對照直接感染A549細胞，感染病毒36 h后收集細胞蛋白，分別用PA和eEF1A1抗體進行IP試驗，所得免疫沉淀物通過Western blot試驗進行驗證。如圖3所示，eEF1A1能夠與CK10病毒PA蛋白相互作用，但不與GS10病毒PA蛋白相互作用。

A.生物學進程；B.細胞組成；C.分子功能A. Biological process; B. Cellular component; C. Molecular function圖1 與PA相互作用差異宿主蛋白的GO功能注釋分析Fig.1 The GO annotation of the different proteins interacting with PA

3 討 論

自1997年在亞洲發現第一個H5N1流感病例，H5N1亞型流感病毒已經迅速地蔓延到不同大洲的60多個國家和地區，給養禽業和人類健康帶來了相當大的損害。流感病毒可以逃逸宿主免疫應答反應并導致持續感染。然而，直到現在，AIV感染的機制尚未完全闡明。病毒感染宿主細胞后，可通過與宿主細胞因子的相互作用，利用宿主細胞的轉錄翻譯系統，在細胞中存活并不斷地繁殖[22]。PA是流感病毒RNA聚合酶的一個亞基，具有多重作用：(1)在病毒轉錄和復制中起重要作用[15]；(2)有助于增強AIV在哺乳動物宿主中的適應性[3,23]；(3)影響流感病毒的毒力[5-6]；(4)與宿主細胞蛋白的“shut-off”有關[7-8]；(5)流感病毒感染過程中，參與宿主的免疫調節[24]。此外，PA基因通過核糖體移碼能夠編碼翻譯PA-X蛋白，PA-X在病毒的生命周期和致病機制中起著重要的作用[25]。

鑒于PA蛋白在流感病毒生命周期和致病機制中的重要作用，挖掘與流感病毒PA蛋白相互作用宿主細胞蛋白對于研究病毒感染的潛在機制和開發新的抗病毒藥物非常重要。而本研究中通過一對主要由PA決定的小鼠致病性差異顯著的模式病毒篩選與PA相互作用差異宿主蛋白，更能挖掘出影響禽流感病毒致病性的宿主因子。

A.KEGG通路聚類分析；B.參與最多的四個通路的蛋白名稱A. Classification of the enriched KEGG pathways of the identified proteins; B. Name of the identified proteins related with the top four KEGG pathways圖2 與PA相互作用差異宿主蛋白的KEGG通路分析Fig.2 The KEGG pathway analysis of the different proteins interacting with PA

許多技術已被用于篩選蛋白間的相互作用，如親和純化結合質譜(AP-MS)和酵母雙雜交(Y2H)，與Y2H相比，AP-MS的使用更為廣泛，因為它可以揭示天然狀態下蛋白質之間的相互作用。在本研究中，應用IP偶聯LC-MS / MS技術，篩選在H5N1流感病毒感染的A549細胞中與PA相互作用的宿主蛋白，這相比于使用PA表達質粒轉染細胞后進行IP偶聯LC-MS / MS相比，不僅在病毒復制期間保留蛋白質的天然構象，而且能夠探索可能與PA間接相互作用的宿主細胞蛋白。

通過上述方法，共篩選到與致病性差異H5N1流感病毒的PA存在相互作用的160種差異人類細胞蛋白。為了進一步探索這些差異宿主細胞蛋白與病毒之間相互作用的生物學意義，對這些宿主蛋白進行了生物信息學分析。基于GO注釋分析結果表明，所篩選的宿主細胞蛋白與病毒感染、翻譯和復制高度相關(圖2)。

通過KEGG通路分析，160個所篩選的差異宿主細胞蛋白中有57種蛋白參與了126條細胞通路。其中參與最多且與病毒感染密切相關的為翻譯相關途徑，涉及到2條細胞通路以及9種宿主蛋白(圖3)。因此，我們推測翻譯途徑在流感病毒感染過程中發揮著至關重要的作用。因為在流感病毒進入宿主細胞后，病毒核糖核蛋白復合物和病毒RNA(vRNPs)被運送到細胞核內，在細胞核中，病毒基因組轉錄成mRNA，然后又被轉運回細胞質并翻譯成病毒蛋白，隨后NP、PB1、PB2和PA蛋白將重新進入細胞核與病毒RNA形成新的RNP復合物[26]。因此，通過將與PA互作宿主細胞蛋白的KEGG通路分析，進一步證實了PA在病毒復制中的關鍵作用。其次還有傳染病相關途徑，包括14條通路和9個所篩選的蛋白(圖3)。在這9種蛋白中，ACTG1和TNFRSF10D與流感病毒感染途徑高度相關，因此我們推測這兩個蛋白可能是造成本研究中兩株禽流感病毒致病性差異的主要宿主因子。同時免疫系統和信號轉導通路也富集較多差異PA互作宿主蛋白，包括抗原的加工和呈遞、NOD樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路和Jak-STAT信號通路等。已有的研究結果表明，PI3K-Akt信號通路在流感病毒感染過程中由NS1激活[27]，發揮著抑制病毒復制的作用[28]；而MAPK信號通路在流感病毒感染期間能夠調節宿主炎性應答反應，從而影響病毒復制[29]。本研究的結果將進一步為研究禽流感病毒對宿主免疫應答的影響提供新的靶標蛋白。

圖3 Co-IP鑒定eEF1A1特異性地與CK10病毒PA蛋白相互作用Fig.3 Identification of eEF1A1 interacts with CK10 PA protein specifically

利用Co-IP試驗，對質譜結果進行了進一步驗證，發現宿主蛋白eEF1A1能夠特異性的與CK10病毒PA蛋白結合。eEF1A1不僅是一種翻譯因子，它還有多種效用，包括調節細胞骨架、伴侶蛋白活性以及調節細胞增殖和細胞死亡[30]。以前的研究表明，eEF1A1與p53蛋白相互作用[31]。P53蛋白也與流感病毒相互作用，抑制p53蛋白表達能夠增強機體先天和適應性免疫系統抵抗流感病毒感染[32]，但是p53發揮此作用的機制仍未可知。因此，我們推測本研究中所鑒定的CK10病毒PA相互作用宿主蛋白eEF1A1可能與p53一起在流感病毒感染過程中發揮著重要作用，當然這需要進一步的試驗進行驗證。

4 結 論

在此研究中，通過比較兩株小鼠致病性差異顯著的H5N1禽流感病毒PA蛋白相互作用的人類細胞蛋白，篩選到160種差異相互作用的人類細胞蛋白。通過GO注釋和KEGG通路分析，結果顯示這些蛋白在病毒感染和病毒復制過程中發揮重要作用，此外Co-IP試驗驗證了宿主蛋白eEF1A1能夠特異性地與CK10病毒PA蛋白相互作用。這為揭示與流感病毒毒力因子PA蛋白相關的分子機制提供了幫助，同時也將加速從宿主層面闡明流感病毒致病機制的步伐。