帕金森病中的CDK5相關通路*

劉佩佩 綜述，朱 艷 審校（揚州大學臨床醫學院/江蘇省蘇北人民醫院神經內科，江蘇揚州225001）

帕金森病（PD）是一種常見于中老年的神經退行性疾病。其發病時以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態障礙為主要的臨床表現。該病具有發病隱匿、進展緩慢、預后差等臨床特點[1-2]。新的流行病學調查結果顯示，中國年齡65歲人群PD患病率超過1%，美國60歲以上人群患病率則接近1%，且隨著年齡的增加而升高。雖然多年來對PD進行了持續性研究，但PD的病因依然不明。目前，普遍認為，遺傳因素、環境因素、神經系統老化等均有所影響[3-4]。其病理則表現為漸進性、選擇性的黑質多巴胺能神經細胞的丟失及殘存神經細胞出現特征性路易小體，且病理變化程度與PD患者癥狀相關[5]。

在許多神經退行性疾病中神經細胞的細胞周期重啟被認為與神經細胞死亡密切相關。細胞周期依賴性激酶（CDK）則被認為在神經細胞的死亡中具有重要作用。其中CDK5不僅在神經細胞中表達較多，還在神經細胞的發育、生長過程中具有重要作用[6]，更是在異常細胞周期重啟中發揮了重要作用[5，7-9]。

目前，PD的具體發病機制仍不明確。近年來，大量研究表明，細胞周期異常重啟在PD發病過程中具有重要作用。而CDK5作為一個特殊的細胞周期蛋白依賴激酶，在很多通路中被觀察到與PD的發生相關，如與肌細胞增強因子2D（MEF2D）、DNA修復酶嘌呤/嘧啶內切酶1（Ape1）等相聯系的信號通路等。現對CDK5在PD的發生中的相關通路進行簡要回顧。

1 CDK5?parkin 途徑

有關PD的遺傳研究結果顯示，至少有9個基因突變被認為與家族性PD相關，其中parkin基因（PARK2）突變較為常見[10]。PARK2突變與常染色體隱性遺傳的青少年型PD發病相關。此外，還有研究表明，PARK2也是散發型PD的危險因素之一[11]。

PARK2包含了12個外顯子，在許多組織中廣泛存在，尤其是在肌肉及大腦中[12]。其編碼具有泛素連接酶活性的parkin蛋白。而泛素作為一種被廣泛需求的轉錄后調節因子在許多細胞通路中起作用，如細胞周期的調控、內吞、DNA修復等。泛素與目的蛋白結合需要泛素活化酶、泛素結合酶及泛素連接酶共同發揮作用。PARK2突變影響了parkin蛋白功能，進而影響其與下游的連接[11，13-14]。

parkin蛋白可受多種內外因素及轉錄后調節，CDK5可磷酸化parkin蛋白。AVRAHAM等[15]研究表明，無論是體內環境還是體外環境，CDK5均可磷酸化parkin蛋白。CDK5主要在S131位點磷酸化parkin蛋白，以調節其泛素連接酶的作用，影響其與底物synphilin-1或絲裂原活化蛋白激酶p38的結合。而synphilin-1則與PD患者包涵體的形成、聚集相關。當parkin蛋白的S131突變時失去了CDK5的磷酸化，S131A的parkin蛋白的泛素連接酶的功能得到加強，更加有利于內涵體的聚集。提示CDK5是parkin蛋白的一個新的調節因子，CDK5對其的磷酸化會增加毒性parkin蛋白底物的聚集，降低多巴胺能神經細胞對毒素的抵制[5，15]。

CDK5在S131位點磷酸化parkin蛋白增強了parkin蛋白作為底物與酪蛋白酶Ⅰ的結合能力。RUBIO DE LA TORRE等[5]對parkin蛋白進一步的研究發現，酪蛋白酶Ⅰ可在S101、S127、S378位點磷酸化parkin蛋白。當這3個位點全部突變時酪蛋白酶Ⅰ則幾乎完全不能與parkin蛋白結合。而當CDK5主要磷酸化的S131位點突變時酪蛋白酶Ⅰ與parkin蛋白的結合程度較野生型降低。同樣情況發生在應用了CDK5的高選擇性抑制劑—— 羅考維停（roscovitine）之后，證明CDK5在S131位點對parkin蛋白磷酸化可使parkin蛋白能更好地與酪蛋白酶Ⅰ結合。

2 鈣依賴蛋白酶（calpain）-絲裂原活化蛋白激酶p35?p25/CDK5?MEF2 途徑

SMITH 等[16]對 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導的PD模型中的CDK5及其上、下游均進行研究發現，MPTP造模后，p25水平上升，但p35水平變化不大，說明p35因鈣蛋白酶作用而轉變為p25在整體中所占的比例不大。使用選擇性鈣蛋白酶抑制劑后，p25水平明顯下降。同時，MPTP作用后CDK5活性明顯上升，而該活性上升程度亦可被鈣蛋白酶抑制劑在一定程度上抑制。但CDK5被鈣蛋白酶抑制劑影響的程度小于p25被影響的程度，說明CDK5活性可能具有更多的影響因素。但鈣蛋白酶在CDK5的活化中仍具有重要作用。

進一步的研究結果顯示，在生理情況下p35缺如小鼠與野生型比較，黑質神經細胞數量、運動功能、酪氨酸羥化酶（TH）均無明顯差異。TH是多巴胺合成限速酶，亦是多巴胺能神經細胞的表型標志物之一，其可被CDK5磷酸化，反過來可使CDK5活性上升。MPTP處理后TH在野生型中的數量卻較p35缺如型明顯下降，而在鈣蛋白酶抑制劑處理的樣本中也觀察到同樣現象。同時，黑質中的神經細胞也與TH保持同樣的變化趨勢。在MPTP模型中p35缺如或鈣蛋白酶抑制劑作用，阻斷了CDK5對下游的影響，從而對神經細胞起到了保護性作用。

MEF2是一種促存活轉錄因子，有A～D 4種亞型，是一個在許多細胞周期過程中具有重要作用的因子，其中包括神經細胞的存活過程。MEF2是多個關鍵性細胞內信號通路的終點，這些通路均影響著細胞的存活和凋亡[17]。SMITH 等[16]和 MOUNT 等[18]研究證實，MEF2在MPTP模型中對多巴胺能神經細胞具有保護作用。

GONG等[19]研究表明，無論是體內實驗還是體外實驗，CDK5均可磷酸化MEF2以抑制其轉錄活性。而神經毒素可增強CDK5活性。進一步研究發現，MEF2轉錄活性主要由其被磷酸化的程度所決定，而并不太受MEF2蛋白量的影響[20]。外源性 dnCDK5（dominant-negative form of CDK5）能加強結合能力，但沒有酶活性，且可通過搶奪p35或p25而影響內源性CDK5的能力。當外源性dnCDK5作用時，與無外源性dnCDK5時比較，被抑制的MEF2活性明顯回升。當應用CDK5高選擇性抑制劑——Roscovitine時結果相同，說明上升的CDK5活性確實抑制了MEF2相關基因轉錄能力。

也有研究發現，CDK5可在S444位點磷酸化MEF2。當S444位點突變時被磷酸化的MEF2明顯較野生型減少。突變的MEF2可抵制CDK5的磷酸化，且可保護神經細胞免于神經毒素引起的細胞凋亡。

3 CDK5?Ape1 途徑

Ape1是氧化或其他因素導致基因損傷后對DNA進行修復的堿基切除修復通路中一個重要的酶。在堿基切除修復通路中Ape1發揮其脫嘌呤/脫嘧啶（AP）內切酶活性，切開AP位點。AP位點可進一步被其他的酶作用以修復DNA。這是氧化性DNA損傷時一條主要的修復途徑[21]。另外，Ape1還具有類似氧化還原因子的作用，可保持轉錄因子處于還原態，這是轉錄因子可進行轉錄的首要條件。

HUANG等[22]對CDK5及Ape1之間的聯系進行研究發現，MPTP作用后可誘導CDK5對Ape1的磷酸化。免疫共沉淀也證實，Ape1直接與p35相連接。且當Ape1的t232位點突變時被CDK5/p35的磷酸化水平明顯下降；當S53位點突變時磷酸化水平輕微下降；當ST2位點突變時對磷酸化無影響。而使用CDK5高選擇性抑制劑——roscovitine可消除所有的磷酸化。說明CDK5/p35直接作用于Ape1，且主要在Thr232位點磷酸化Ape1。進一步采用p35-/-的模型進行相關研究，依然未發現磷酸化的Ape1。說明在MPTP模型中Ape1的磷酸化只由CDK5所引導。

進一步研究CDK5介導的Ape1磷酸化對其功能的影響時發現，Thr232位于Ape1的C′端，已被證實與Ape1的 AP內切酶活性相關[23]。分別突變 T232、S53、ST2位點，并分別在CDK5/p25陰性、CDK5/p25陰性的情況下，比較其相應的AP內切酶活性，結果顯示，CDK5雖對多個位點具有磷酸化作用，但只在Thr232位點的磷酸化會降低Ape1內切酶活性。抑制CDK5活性時可明顯提升AP內切酶活性。

有研究對Ape1進行了小干擾RNA轉染，并對相應的神經細胞進行熒光標記。在MPTP模型中發現，未轉染Ape1時存活的神經細胞較多。而轉染后Ape1功能受影響，死亡了較多的神經細胞。證實在MPTP模型中Ape1對神經細胞具有保護作用。而CDK5對Ape1的磷酸化，降低了其AP內切酶活性，影響了Ape1的功能，降低了其對神經細胞的保護作用，從而加重了MPTP模型中神經細胞死亡及DNA損傷。

此外，BUSSO等[24]報道，CDK5可增強內源性Ape1泛素化，而Ape1泛素化可能與其修復DNA功能及基因調節能力具有內在聯系，但目前其具體機制尚不明確。

4 CDK5?過氧化物還原酶 2（Prx2）途徑

Prx2是一種具有過氧化物酶活性的抗氧化劑，而氧化應激也是PD的可能致病因素之一[25]。有研究對Prx2及PD之間關系進行了探討。

QU等[26]研究發現，在MPTP作用的細胞或小鼠模型中Prx2直接通過p35與CDK5結合。當p35-/-時Prx2磷酸化水平有所下降，但不是完全的改變，可能由于絲裂原活化蛋白激酶p39存在的緣故。因而改用CDK5高選擇性抑制劑——roscovitine，Prx2磷酸化水平同樣下降了，證實Prx2的磷酸化確實受CDK5的影響。進而推測CDK5可能是在T89位點磷酸化Prx2。該研究分別檢測了野生型Prx2及T89位點突變的Prx2在MPTP作用下的磷酸化水平，結果顯示，Prx2在T89A位點上幾乎未檢測到磷酸化，從而說明CDK5對Prx2的磷酸化發生在T89位點。

那么，CDK5對Prx2的磷酸化對其功能有何影響呢？有研究將磷酸化Prx2與未磷酸化Prx2分離，采取相同的數量以評估磷酸化前后Prx2過氧化物酶活性，結果顯示，磷酸化Prx2過氧化物酶活性僅為未磷酸化Prx2的37%，即磷酸化Prx2過氧化物酶活性明顯降低。所以，CDK5在T89位點磷酸化Prx2，降低了Prx2過氧化物酶活性。

Prx2活性降低的影響可通過Prx2在MPTP模型中作用來說明：（1）經MPTP處理后Prx2含量并未明顯增高，但磷酸化Prx2含量卻發生了顯著變化。（2）Prx2的活性受T89位點磷酸化影響，Prx2的存在可顯著保護神經細胞免于死亡。而Prx2 T89A影響了CDK5對Prx2的磷酸化，同樣表現出毒性情況下對神經細胞的顯著保護作用。而應用干擾小RNA干擾了Prx2的表達時神經細胞也相應地對MPTP毒性更加敏感，存活更少[27]。表明Prx2對神經細胞具有保護作用。MPTP作用的模型中CDK5在T89位點磷酸化Prx2，降低了Prx2過氧化物酶活性，降低了Prx2的保護作用，則可加重神經細胞死亡[26，28]。

上述途徑并不只存在于PD或相關模型中，在其他疾病中也存在并發揮著相應作用，如CDK5與Prx2在缺血損傷模型中也具有重要關聯[29]。但其在具體不同疾病中所起的作用及作用大小仍需進行相關的研究加以證實。此外，CDK5與PD之間尚存在其他的可能途徑，如CDK5與α-核突觸蛋白（α-synuclein）之間存在關聯，CDK5 可促進 α-synuclein 聚集[8-9，30]，但具體的路徑尚不清楚，尚有待于進一步研究。

綜上所述，CDK5在PD的神經細胞死亡中發揮了重要作用，其有可能是PD治療的一個靶點。但由于CDK5具有復雜的生物學效應，在成為治療靶點前尚有大量疑問需進一步研究澄清。

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